Análisis de seguimiento de nanopartículas de nanopartículas de oro en medios acuosos a través de una comparación entre laboratorios
Summary
El protocolo descrito aquí tiene como objetivo medir el diámetro hidrodinámico de las nanopartículas esféricas, más específicamente las nanopartículas de oro, en medios acuosos mediante el Análisis de Seguimiento de Nanopartículas (NTA). Este último consiste en rastrear el movimiento de las partículas debido al movimiento browniano e implementar la ecuación Stokes-Einstein para obtener el diámetro hidrodinámico.
Abstract
En el campo de la nanotecnología, la caracterización analítica desempeña un papel vital en la comprensión del comportamiento y la toxicidad de los nanomateriales (NMs). La caracterización debe ser exhaustiva y la técnica elegida debe ser adecuada para la propiedad a determinar, el material que se está analizando y el medio en el que está presente. Además, el funcionamiento del instrumento y la metodología deben ser bien desarrollados y claramente comprendidos por el usuario para evitar errores de recopilación de datos. Cualquier discrepancia en el método o procedimiento aplicado puede dar lugar a diferencias y mala reproducibilidad de los datos obtenidos. Este documento tiene como objetivo aclarar el método para medir el diámetro hidrodinámico de las nanopartículas de oro mediante el Análisis de Seguimiento de Nanopartículas (NTA). Este estudio se llevó a cabo como una comparación entre laboratorios (ILC) entre siete laboratorios diferentes para validar el rendimiento y la reproducibilidad del procedimiento operativo estándar. Los resultados obtenidos de este estudio de ILC revelan la importancia y los beneficios de los procedimientos operativos estándar detallados (SOP), las actualizaciones de mejores prácticas, el conocimiento del usuario y la automatización de mediciones.
Introduction
Los nanomateriales (NMs) pueden variar tanto en características físicas como químicas que a su vez influyen en su comportamiento, estabilidad y toxicidad1,2,3,4,5. Una de las principales dificultades, al desarrollar una comprensión exhaustiva de las propiedades, peligros y comportamientos de NM, es la capacidad de obtener información reproducible sobre características nanomateriales físicas y químicas. Ejemplos de estas propiedades físicas incluyen tamaño de partícula y distribución de tamaño6,7,8. Se trata de parámetros importantes, ya que son un aspecto clave de la definición de la Comisión Europea (CE) del término «nano»9.
Lograr mediciones precisas del tamaño de las partículas también es fundamental para muchas aplicaciones y procesos industriales y de investigación diferentes, además de comprender el destino y los efectos de toxicidad de los NMs6,10. Es importante tener métodos bien establecidos capaces de medir con precisión, fiabilidad y reproduciblemente el tamaño de los NMs. Además, la información notificada debe proporcionar una comprensión profunda de la técnica utilizada, por ejemplo, indicar el parámetro de tipo de tamaño (por ejemplo, tamaño real o tamaño hidrodinámico), así como la condición de la muestra, por ejemplo, el medio específico en el que está presente el NM y que el método funcione de forma fiable en diferentes medios. Con el fin de medir el tamaño, se pueden utilizar una serie de técnicas, incluyendo microscopía electrónica (EM), dispersión dinámica de luz (DLS), espectrometría de masa plasmática de una sola partícula inductivamente acoplada (SPICP-MS), sedimentación centrífuga diferencial (DCS), microscopía de sonda de barrido (SPM), dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) y análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA).
NTA es una tecnología relativamente nueva que ha sido muy avanzada en los últimos años y se ha demostrado que mide de forma fiable el diámetro hidrodinámico de los NMs esféricos en medios acuosos complejos como aquellos con relevancia ambiental, por ejemplo, sistemas de agua dulce. El diámetro hidrodinámico es «del tamaño de una hipotética esfera dura que se difunde de la misma manera que la de la partícula que se mide»11; en términos prácticos y en medios acuosos esto describe un diámetro mayor que el de la propia partícula, que también incluye una capa de moléculas (principalmente agua) sostenidas en la superficie de la partícula por fuerzas electrostáticas débiles. El diámetro hidrodinámico de una partícula variará en diferentes medios, haciéndose más pequeño a medida que la fuerza iónica del medio en el que se mide se eleva.
Una característica adicional importante de la técnica NTA es que permite al analista lograr mediciones de tamaño ponderado por números, que son necesarias en el contexto de la definición de nanomaterial ce. El análisis de partículas por partículas de alta resolución hace que esta técnica sea menos propensa a interferencias causadas por aglomerados o partículas más grandes cuando está presente en una muestra de prueba heterogénea con una alta tasa de rendimiento de partículas10,12.
El procedimiento de medición consiste en preparar una suspensión adecuada de la muestra, que a menudo requiere dilución de la muestra, seguida de la grabación de vídeo del comportamiento del movimiento browniano de las partículas y el análisis de vídeo. Desde la cámara de muestra, se pasa un rayo láser, y las partículas de suspensión en el camino del rayo láser dispersan la luz que conduce a su visualización utilizando un microscopio óptico con una cámara montada. La cámara captura un archivo de vídeo de la luz láser dispersa de las partículas que se mueven bajo el movimiento browniano. Muchas partículas se pueden rastrear individualmente para determinar sus coeficientes de difusión y sus diámetros hidrodinámicos se pueden calcular utilizando la ecuación Stokes-Einstein: d = kT/3πεD donde d es el diámetro hidrodinámico, k es la constante Boltzmann, T es la temperatura, η es la viscosidad y D es el coeficiente de difusión10. NTA también se puede utilizar para realizar un seguimiento del comportamiento de agregación de partículas que son generalmente coloidalmente inestables (las partículas deben, sin embargo, ser coloidalmente estables en la escala de tiempo de medición)13,14. NTA es un método absoluto y no se requiere calibración del sistema en el instrumento utilizado en este trabajo. Si los usuarios quieren comprobar el rendimiento del sistema, esto se puede hacer fácilmente midiendo los materiales estándar de tamaño con la frecuencia que desee.
El instrumento NTA es fácil de operar con un tiempo de análisis rápido (menos de 10 minutos por muestra). Para mediciones de alta calidad con buena repetibilidad de datos y reproducibilidad, se deben considerar una serie de factores tanto en la preparación de muestras como en el funcionamiento del instrumento. Si estos factores no se consideran cuidadosamente, las mediciones del mismo material en diferentes laboratorios y operadores pueden estar sujetas a incertidumbres desconocidas o mal cuantificadas. Durante la caracterización np, el uso de las mejores prácticas en los SOP desarrollados internamente no siempre garantiza la coherencia con otros laboratorios, como se muestra por Roebben et al. para la técnica DLS15.
De hecho, una ILC NTA temprana (primera ronda) entre diferentes laboratorios, usuarios e instrumentos reveló resultados inconsistentes. Una de las principales cuestiones fue el uso de varios instrumentos heredados antiguos que no habían tenido servicios regulares o controles de calibración, así como diferencias en la interpretación del método. Un estudio de NTA ILC realizado por Hole et al. encontró que con la ausencia de directrices compartidas sobre cómo utilizar un sistema y preparar muestras, la variabilidad entre laboratorios puede ser grande incluso para muestras relativamente monodispersadas16. Esto junto con los resultados de la primera ronda de la CIT pone de relieve la necesidad de un buen mantenimiento de los instrumentos, así como la capacitación en métodos y los procedimientos operativos estándar (SOP) bien desarrollados. Estos últimos actúan como una poderosa herramienta para describir y documentar el cumplimiento de las buenas prácticas. Si está bien detallado, los procedimientos operativos estándar (SOP) pueden ofrecer claridad, explicación, comprensión, estandarización y garantía de calidad.
Por lo tanto, la recomendación de adoptar un estudio de ILC es ideal tanto para el desarrollo como para los protocolos de ensayo16. El ejercicio de la CIT actuó para validar este SOP específico de la NTA y, por lo tanto, introdujo confianza y claridad en este método específico de evaluación del riesgo de nanomateriales. Se trataba de tres balas. La Ronda 1 analizó nanopartículas de oro de 60 nm en los propios instrumentos de cada participante antes del entrenamiento. La ronda 2 implicó analizar el látex de 100 nm utilizando un nuevo instrumento con una configuración común como una prueba simple con el fin de determinar que el instrumento se estableció correctamente y los usuarios tenían un buen conocimiento sobre cómo utilizar el instrumento. La ronda 3 implicó el análisis de nanopartículas de oro de 60 nm en el nuevo instrumento con configuración común, después del entrenamiento. Los participantes en la ILC procedían de siete laboratorios diferentes, todos ellos miembros del consorcio horizonte 2020 ACEnano proyecto17.
El objetivo de este artículo es discutir el método y los resultados de una tercera ronda de benchmarking para la tecnología NTA donde los NPs de oro de 60 nm fueron reexamenados por siete socios después de una formación detallada y el desarrollo de SOP. También se hará una comparación y referencia a los resultados obtenidos en la primera ronda del ILC. Todos los análisis de la ronda 3 de ILC se llevaron a cabo utilizando el mismo instrumento (véase Tabla de materiales)de idéntica configuración suministrado con un láser de 405 nm y una cámara sCMOS de alta sensibilidad. Benchmarking evalúa el rendimiento de la tecnología en muestras y, por lo tanto, conduce al desarrollo de protocolos de “mejores prácticas”. Por lo tanto, este artículo también comparte y pone a disposición de la comunidad científica el método NTA para el instrumento utilizado en este CIT, ya que se ha armonizado mediante la realización y evaluación de las CCI de acuerdo con las normas internacionales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los resultados incoherentes obtenidos de la CIT de la Ronda 1 destacaron la necesidad de controles de salud de instrumentos para sistemas más antiguos, así como el desarrollo de un SOP más detallado, la necesidad de capacitación práctica y una mejor comprensión de los ajustes de medición y análisis a fin de garantizar resultados más consistentes en los diferentes laboratorios. De hecho, Hole et al. constató que la ausencia de directrices compartidas sobre cómo utilizar un sistema NTA y preparar muestras dio lugar a variabilidad en todos los laboratorios, incluso para muestras relativamente monodispersadas16. Por lo tanto, todos los participantes de ILC asistieron a un taller de capacitación que cubre las mejores prácticas para el funcionamiento del sistema y las condiciones de medición, así como orientación de limpieza y mantenimiento para el instrumento específico de la NTA. Todos los participantes también realizaron mediciones en el mismo instrumento en sus propios laboratorios para las rondas posteriores de ILC. El procedimiento involucró primero una ronda que probó el sistema localmente en cada laboratorio mediante la ejecución de un ILC en muestras estándar de látex (ILC Ronda 2), antes de ser utilizado por los socios para repetir las mediciones de oro (ILC Ronda 3). El objetivo de medir estas muestras de oro mediante NTA era introducir confianza y claridad en los métodos y prácticas de evaluación del riesgo de nanomateriales necesarios para afectar a los protocolos de orientación sobre nanoseguridad.
NTA es una técnica que puede medir el diámetro equivalente hidrodinámico de las partículas y se puede utilizar para el análisis visual partícula por partícula en tiempo real de sistemas polidispersados que van desde 10 nm – 50 nm, hasta aproximadamente 1000 nm de tamaño (dependiendo de las propiedades de la muestra y la configuración del instrumento). Se requiere una preparación mínima de la muestra. A pesar de la mínima preparación de la muestra, este paso es fundamental para el protocolo y se debe tener mucho cuidado al diluir una muestra y elegir un diluyente. La forma puede ser un factor limitante con respecto a la NTA a medida que se obtienen mediciones de tamaño equivalente esférico y las partículas no esféricas tendrán un valor de tamaño menos preciso.
Para la tecnología NTA, siempre es de esperar alguna variación de resultados, ya que solo se observa una muestra representativa de toda la muestra. A pesar de todo, todos los resultados cumplen con el estándar ISO 19430 para el dimensionamiento de partículas. La concentración óptima a proporcionar es típicamente alrededor de 108 partículas/ml dentro de un tiempo de análisis de 30-60 segundos. Para las muestras con concentraciones de partículas más bajas, se requerirán tiempos de análisis más largos para garantizar resultados reproducibles. Para las muestras que contienen una concentración de partículas superiores a 109 partículas/ml, existe una mayor probabilidad de problemas de seguimiento y las muestras deberán diluirse a un rango adecuado para la medición de la NTA.
En general, los resultados de la ILC redonda de 3rd muestran una buena reproducibilidad de las mediciones de nanopartículas de oro con NTA con mayor precisión y repetibilidad. Todas las mediciones de NTA se llevaron a cabo utilizando el nivel automático de la cámara y los ajustes de enfoque para ajustar la imagen, según lo seleccionado por la función de configuración automática en el software. El nivel de cámara establecido por el software era muy consistente, con un nivel de cámara de 10 u 11 que se establece en todos los casos que muestra que, como se esperaba, más automatización incluye un proceso, más consistencia se logra. Los resultados del tamaño fueron comparables a los obtenidos por el fabricante a través de TEM indicando que los resultados eran reproducibles, sin embargo, se esperan diferencias mínimas de diferentes técnicas ya que TEM no determina el diámetro hidrodinámico. La mejora significativa en la consistencia de los resultados muestra la importancia y los beneficios del mantenimiento de los instrumentos, sops detallados, actualizaciones de mejores prácticas, conocimiento del usuario y automatización de medición aplicada para NTA. En conclusión, la CIT validó este SOP específico de la NTA y, por lo tanto, introdujo confianza y claridad en este método específico de evaluación del riesgo de nanomateriales.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el apoyo financiero del proyecto financiado por H2020: ACEnano (Acuerdo de Subvención nº 720952). Esta labor también contó con el apoyo parcial del Programa Internacional de I+D cooperativa financiado por el Ministerio de Comercio, Industria y Energía de Corea (número de subvención N053100009, “Horizon2020 Kor-EU collaborative I&BD on ACEnano Toolbox”) que permitió la participación de los socios coreanos en el consorcio del Proyecto ACEnano Horizonte 2020.
Materials
| 60 nm gold colloid dispersion | BBI Solutions OEM Ltd. | Product EM. GC60, Batch number 024650 | |
| 0.02 µm syringe filter – Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters | Sigma Aldrich | WHA68092102 | |
| NanoSight | Malvern Panalytical Ltd. | NS300 | |
| NanoSight NTA Software v3.4 | Malvern Panalytical Ltd. | v3.4 | |
| Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1 mL, graduated, 0.01 mL, sterile | Sigma Aldrich | Z230723 |
References
- Thwala, M., Musee, N., Sikhwivhilu, L., Wepener, V. The oxidative toxicity of Ag and ZnO nanoparticles towards the aquatic plant Spirodela punctuta and the role of testing media parameters. Environmental Science-Processes and Impacts. 15 (10), 1830-1843 (2013).
- Lowry, G. V., Gregory, K. B., Apte, S. C., Lead, J. R. Transformations of nanomaterials in the environment. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6893-6899 (2012).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Valsami-Jones, E., Lynch, I. How safe are nanomaterials. Science. 350 (6259), 388-389 (2015).
- Briffa, S. M., Nasser, F., Valsami-Jones, E., Lynch, I. Uptake and impacts of polyvinylpyrrolidone (PVP) capped metal oxide nanoparticles on Daphnia magna: role of core composition and acquired corona. Environmental Science: Nano. 5, 1745-1756 (2018).
- Hassellöv, M. a. R. K. . Analysis and Characterization of Manufactured Nanoparticles in Aquatic Environments. Environmental and Human Health Impacts of Nanotechnology. , 211-266 (2009).
- Hoet, P., Brüske-hohlfeld, I., Salata, O. Nanoparticles and known and unknown health risks. Journal of Nanobiotechnology. 2 (1), 12 (2004).
- Briffa, S. M., et al. Thermal transformations of manufactured nanomaterials as a proposed proxy for ageing. Environmental Science: Nano. 5, 1618-1627 (2018).
- Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).
- Walker, J. G. Improved nano-particle tracking analysis. Measurement Science and Technology. 23 (6), 065605 (2012).
- Using NTA to Study Aggregation Behavior of Liposome-Protein Complexes. Malvern Panalytical Available from: https://www.news-medical.net/whitepaper/20161125/Using-NTA-to-Study-Aggregation-Behavior-of-Liposome-Protein-Complexes.aspx (2019)
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Roebben, G., et al. Interlaboratory comparison of size and surface charge measurements on nanoparticles prior to biological impact assessment. Journal of Nanoparticle Research. 13 (7), 2675 (2011).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research: An Interdisciplinary Forum for Nanoscale Science and Technology. 15 (12), 2101 (2013).
- Analytical and Characterisation Excellence in nanomaterial risk assessment: A tiered approach. ACEnano Available from: https://cordis.europa.ue/project/id/720952 (2019)
- Soille, P., Vincent, L. . Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. 1360, (1990).
