Analyse du suivi des nanoparticules d’or dans les médias aqueux par le biais d’une comparaison inter-laboratoire
Summary
Le protocole décrit ici vise à mesurer le diamètre hydrodynamique des nanoparticules sphériques, plus particulièrement les nanoparticules d’or, dans un média aqueux au moyen de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Ce dernier consiste à suivre le mouvement des particules en raison du mouvement brownien et à mettre en œuvre l’équation Stokes-Einstein pour obtenir le diamètre hydrodynamique.
Abstract
Dans le domaine de la nanotechnologie, la caractérisation analytique joue un rôle essentiel dans la compréhension du comportement et de la toxicité des nanomatériaux (NM). La caractérisation doit être approfondie et la technique choisie doit être bien adaptée à la propriété à déterminer, au matériau analysé et au milieu dans lequel il est présent. En outre, le fonctionnement et la méthodologie des instruments doivent être bien développés et clairement compris par l’utilisateur pour éviter les erreurs de collecte de données. Toute anomalie dans la méthode ou la procédure appliquée peut entraîner des différences et une mauvaise reproductibilité des données obtenues. Cet article vise à clarifier la méthode de mesure du diamètre hydrodynamique des nanoparticules d’or au moyen de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Cette étude a été réalisée à titre de comparaison inter-laboratoire (ILC) entre sept laboratoires différents afin de valider les performances et la reproductibilité de la procédure d’exploitation standard. Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude du CEI révèlent l’importance et les avantages des procédures d’exploitation normalisées détaillées (SSP), des mises à jour des pratiques pratiques, des connaissances des utilisateurs et de l’automatisation des mesures.
Introduction
Les nanomatériaux (NMs) peuvent varier dans les caractéristiques physiques et chimiques qui à leur tour influencent leur comportement, stabilité, et toxicité1,2,3,4,5. L’une des principales difficultés, lors de l’élaboration d’une compréhension approfondie des propriétés, des dangers et des comportements nm, est la capacité d’obtenir des informations reproductibles sur les caractéristiques des nanomatériaux physiques et chimiques. Des exemples de telles propriétés physiques incluent la taille et la distribution de taillede particules 6,7,8. Il s’agit de paramètres importants car ils sont un aspect clé de la définition par la Commission européenne (CE) du terme « nano »9.
La réalisation de mesures précises de la taille des particules est également essentielle pour de nombreuses applications et processus industriels et de recherche, en plus de comprendre le sort et les effets de toxicité des MR6,10. Il est important d’avoir des méthodes bien établies capables de mesurer avec précision, fiabilité et reproductibilité la taille des MR. De plus, les renseignements communiqués devraient fournir une compréhension approfondie de la technique utilisée, par exemple, indiquer le type de paramètre de taille (p. ex., taille réelle ou taille hydrodynamique) ainsi que l’état de l’échantillon, par exemple, le milieu spécifique dans lequel le MN est présent, et pour que la méthode fonctionne de façon fiable dans différents médias. Afin de mesurer la taille, un certain nombre de techniques peuvent être utilisées, y compris la microscopie électronique (EM), la diffusion dynamique de la lumière (DLS), la spectrométrie de masse plasmatique couplée inductivement à une seule particule (SPICP-MS), la sédimentation centrifuge différentielle (DCS), la microscopie de sonde à balayage (SPM), la diffusion de rayons X à petit angle (SAXS) et l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA).
La NTA est une technologie relativement nouvelle qui a été bien avancée ces dernières années et qui a été démontrée pour mesurer de façon fiable le diamètre hydrodynamique des MR sphériques dans des médias complexes et aqueux comme ceux qui ont une pertinence environnementale, par exemple les systèmes d’eau douce. Le diamètre hydrodynamique est « la taille d’une sphère dure hypothétique qui se diffuse de la même manière que celle de la particule mesurée »11; en termes pratiques et dans un média aqueux, cela décrit un diamètre plus grand que celui de la particule elle-même, qui comprend également une couche de molécules (principalement de l’eau) maintenues à la surface de la particule par de faibles forces électrostatiques. Le diamètre hydrodynamique d’une particule varie selon les médias, de plus en plus petit à mesure que la force ionique du média dans lequel elle est mesurée devient plus élevée.
Une autre caractéristique importante de la technique NTA est qu’elle permet à l’analyste d’obtenir des mesures de taille pondérées en fonction du nombre, qui sont requises dans le contexte de la définition des nanomatériaux des CE. L’analyse à haute résolution, particules par particules, rend cette technique moins sujette aux interférences causées par les aggloméates ou les particules plus grosses lorsqu’elles sont présentes dans un échantillon d’essai hétérogène avec un taux élevé de débit departicules 10,12.
La procédure de mesure consiste à préparer une suspension appropriée de l’échantillon, ce qui nécessite souvent une dilution de l’échantillon, suivie d’un enregistrement vidéo du comportement de mouvement brownien des particules et de l’analyse vidéo. De la chambre d’échantillon, un faisceau laser est passé, et les particules de suspension dans le chemin du faisceau laser dispersent la lumière menant à leur visualisation à l’aide d’un microscope optique avec une caméra montée. La caméra capture un fichier vidéo de la lumière laser éparse des particules se déplaçant sous le mouvement brownien. Beaucoup de particules peuvent être suivies individuellement pour déterminer leurs coefficients de diffusion et leurs diamètres hydrodynamiques peuvent être calculés à l’aide de l’équation Stokes-Einstein: d = kT/3ννD où d est le diamètre hydrodynamique, k est la constante Boltzmann, T est la température, η est la viscosité et D est le coefficient de diffusion10. NTA peut également être utilisé pour suivre le comportement d’agrégation des particules qui sont généralement colloïdes instables (les particules doivent, cependant, être colloïdally stable sur l’échelle de temps de mesure)13,14. NTA est une méthode absolue et aucun étalonnage du système n’est requis sur l’instrument utilisé dans ce travail. Si les utilisateurs veulent vérifier les performances du système cela peut être facilement fait en mesurant les matériaux standard de taille aussi fréquemment que voulu.
L’instrument NTA est facile à utiliser avec un temps d’analyse rapide (moins de 10 min par échantillon). Pour les mesures de haute qualité avec une bonne répétabilité et reproductibilité des données, un certain nombre de facteurs devraient être pris en compte à la fois dans la préparation de l’échantillon ainsi que dans le fonctionnement des instruments. Si ces facteurs ne sont pas soigneusement pris en compte, les mesures effectuées sur le même matériau dans différents laboratoires et opérateurs peuvent être sujettes à des incertitudes inconnues ou mal quantifiées. Au cours de la caractérisation du PN, l’utilisation de sops développés à l’interne ne garantit pas toujours la cohérence avec les autres laboratoires, comme le montrent Roebben et coll. pour la technique DLS15.
En fait, un CNT NTA précoce (premier tour) entre différents laboratoires, utilisateurs et instruments a révélé des résultats incohérents. L’un des principaux problèmes était l’utilisation de divers instruments hérités plus anciens qui n’avaient pas eu de services réguliers ou de vérifications d’étalonnage, ainsi que des différences dans l’interprétation des méthodes. Une étude du CIT de Hole et coll. a révélé qu’en l’absence de lignes directrices communes sur la façon d’utiliser un système et de préparer des échantillons, la variabilité entre les laboratoires peut être importante même pour les échantillons relativement monopersés16. Ceci, ainsi que les résultats de la première série de la CIT, souligne la nécessité d’une bonne maintenance des instruments ainsi que d’une formation aux méthodes et de procédures d’exploitation standard (SSP) bien développées. Ces derniers agissent comme un outil puissant pour décrire et documenter le respect des bonnes pratiques. Si elles sont bien détaillées, les procédures d’exploitation normalisées peuvent offrir clarté, explication, compréhension, normalisation et assurance de la qualité.
La recommandation d’adopter une étude du CEI est donc idéale pour l’élaboration et l’essai de protocoles16. L’exercice du CEI a servi à valider ce SOP NTA spécifique et a donc introduit la confiance et la clarté dans cette méthode spécifique d’évaluation des risques nanomatériaux. Il a impliqué trois tours. La première ronde a analysé des nanoparticules d’or de 60 nm sur les instruments de chaque participant avant l’entraînement. La deuxième série consistait à analyser le latex de 100 nm à l’aide d’un nouvel instrument avec une configuration commune comme simple test afin de déterminer que l’instrument a été mis en place correctement et que les utilisateurs avaient une bonne connaissance de la façon d’utiliser l’instrument. La troisième série comprenait l’analyse de nanoparticules d’or de 60 nm sur le nouvel instrument à configuration commune, après l’entraînement. Les participants à la CIT provenaient de sept laboratoires différents, tous membres du consortium du projet Horizon 2020 ACEnano17.
L’objectif de cet article est de discuter de la méthode et des résultats d’une troisième série d’analyses comparatives pour la technologie NTA où les PN or de 60 nm ont été ré-analysés par sept partenaires à la suite d’une formation détaillée et du développement du SOP. La comparaison et la référence aux résultats obtenus au premier tour de la CIT seront également faites. Toutes les analyses de la troisième série d’ILC ont été réalisées à l’aide du même instrument (voir tableau des matériaux)d’une configuration identique fournie avec un laser de 405 nm et une caméra sCMOS haute sensibilité. L’analyse comparative évalue le rendement de la technologie sur les échantillons et mène donc à l’élaboration de protocoles de « meilleures pratiques ». Ainsi, cet article partage et met également la méthode NTA pour l’instrument utilisé dans ce CIT à la disposition de la communauté scientifique car elle a été harmonisée par la conduite et l’évaluation des CDI selon les normes internationales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les résultats incohérents obtenus lors de la première série de la CIT ont mis en évidence la nécessité de vérifier la santé des instruments pour les anciens systèmes ainsi que l’élaboration d’un SOP plus détaillé, la nécessité d’une formation pratique et une meilleure compréhension des paramètres de mesure et d’analyse afin d’assurer des résultats plus cohérents dans les différents laboratoires. En fait, Hole et coll. ont constaté que l’absence de lignes directrices communes sur la façon d’utiliser un système de LNR et de préparer des échantillons a entraîné une variabilité entre les laboratoires, même pour les échantillons relativement monopersés16. Par conséquent, tous les participants du CEI ont assisté à un atelier de formation portant sur les meilleures pratiques pour le fonctionnement et les conditions de mesure du système, ainsi que sur les directives de nettoyage et d’entretien de l’instrument spécifique de l’ONT. Tous les participants ont également effectué des mesures sur le même instrument dans leurs propres laboratoires pour les rondes ultérieures du CEI. La procédure consistait d’abord à mettre à l’essai le système localement dans chaque laboratoire en exécutant un CIT sur des échantillons standard en latex (ilc round 2), avant d’être utilisée par les partenaires pour répéter les mesures d’or (ilc round 3). L’objectif de la mesure de ces échantillons d’or au moyen de la NTA était d’introduire la confiance et la clarté dans les méthodes et les pratiques d’évaluation des risques nanomatériaux nécessaires pour avoir un impact sur les protocoles de guidage de nanosécurité.
NTA est une technique qui peut mesurer le diamètre équivalent sphérique hydrodynamique des particules et peut être utilisé pour les particules par particule, l’analyse visuelle en temps réel des systèmes polydispersés allant de 10 nm – 50 nm, à environ 1000 nm de taille (selon les propriétés de l’échantillon et la configuration de l’instrument). Une préparation minimale de l’échantillon est nécessaire. Malgré une préparation minimale de l’échantillon, cette étape est essentielle pour le protocole et un grand soin doit être pris lors de la dilution d’un échantillon et le choix d’un diluant. La forme peut être un facteur limitatif en ce qui concerne nta que les mesures de taille équivalent sphérique sont obtenus et les particules non sphériques auront une valeur de taille moins précise.
Pour la technologie NTA, il faut toujours s’attendre à une certaine variation des résultats, car seul un échantillon représentatif est observé à partir de l’ensemble de l’échantillon. Quoi qu’il en soit, tous les résultats répondent à la norme ISO 19430 pour le dimensionnement des particules. La concentration optimale à fournir est généralement d’environ 108 particules/ml dans un temps d’analyse de 30-60 secondes. Pour les échantillons ayant des concentrations de particules plus faibles, des temps d’analyse plus longs seront nécessaires pour assurer des résultats reproductibles. Pour les échantillons contenant une concentration de particules supérieures à 109 particules/mL, il est plus probable que les problèmes de suivi et les échantillons devront être dilués jusqu’à une plage appropriée pour la mesure de la NTA.
Dans l’ensemble, les résultats de la3ème ronde ILC montrent une bonne reproductibilité des mesures de nanoparticules d’or avec NTA avec une précision et une répétabilité accrues. Toutes les mesures NTA ont été effectuées en utilisant le niveau de la caméra automatique et les paramètres de mise au point pour ajuster l’image, tel que sélectionné par la fonction Auto-Setup dans le logiciel. Le niveau de la caméra fixé par le logiciel était très cohérent, avec un niveau de caméra de 10 ou 11 étant défini dans tous les cas montrant que, comme prévu, plus un processus comprend l’automatisation, plus la cohérence est atteinte. Les résultats de dimensionnement étaient comparables à ceux obtenus par le fabricant au moyen de TEM indiquant que les résultats étaient reproductibles, mais des différences minimales sont à prévoir à partir de différentes techniques puisque TEM ne détermine pas le diamètre hydrodynamique. L’amélioration significative de la cohérence des résultats montre l’importance et les avantages de la maintenance des instruments, des SOP détaillés, des mises à jour des meilleures pratiques, des connaissances des utilisateurs et de l’automatisation appliquée des mesures pour la NTA. En conclusion, la CIT a validé ce SOP NTA spécifique et a donc introduit la confiance et la clarté dans cette méthode spécifique d’évaluation des risques nanomatériaux.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent le soutien financier du projet financé par la grippe H2020 : ACEnano (Accord de subvention no 720952). Ces travaux ont également été partiellement soutenus par le Programme international coopératif de R&D financé par le Ministère du commerce, de l’industrie et de l’énergie de Corée (numéro de subvention N053100009, « Horizon2020 Kor-EU collaborative R&BD sur ACEnano Toolbox ») qui a permis la participation des partenaires coréens au consortium du projet Horizon 2020 ACEnano.
Materials
| 60 nm gold colloid dispersion | BBI Solutions OEM Ltd. | Product EM. GC60, Batch number 024650 | |
| 0.02 µm syringe filter – Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters | Sigma Aldrich | WHA68092102 | |
| NanoSight | Malvern Panalytical Ltd. | NS300 | |
| NanoSight NTA Software v3.4 | Malvern Panalytical Ltd. | v3.4 | |
| Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1 mL, graduated, 0.01 mL, sterile | Sigma Aldrich | Z230723 |
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