ナノ粒子追跡分析と実験間比較による水性メディアにおける金ナノ粒子の解析

ここで説明する方法論は、実験室間比較の第3ラウンドに使用された。 1. サンプルの準備 0.02 μmのシリンジフィルターを通して水をろ過します。水のろ過は、サンプル希釈のためにそれを使用する前に、任意の汚染粒子を除去するために必要です。 作製したサンプルを分析するには、60 nmの金コロイド分散液のサンプルを、ろ過された超純水で50倍ずつ大きく希釈します。NTA分析の推奨濃度は、1 mL当たり1 x10 9粒子 です。 2. 測定を行う システムのスイッチを入れます。 NTA機器、シリンジポンプ、コンピュータを接続します。ハードウェアとソフトウェアの電源を入れ替えます。関連付けられているソフトウェア ( 材料表を参照) により、すべてのハードウェア通信が実行され、ライブ温度読み出しが表示されます。 NTAからレーザーモジュールを取り外し、組織と圧縮空気を使用して、ガラス表面と低体積フローセル(LVFC)内部チャネル、チューブ、および流体ポートを完全に乾燥させます。 チューブのプライミング 入口の流体チューブを超純水でリンスして粒子を除去し、測定を妨げる気泡の可能性を低減します。すすいのために、器械の包装の内部の入口の管の端は無駄な容器に置かれる。 1 mL (針なし) の水を Luer ポートに挿入し、バック圧力が許す限り速く入口チューブを通して液体の約 900 μL を押します。残りの液体を含む注射器を取り付けて、任意のサイフォンを防止します。 シリンジポンプチューブ接続 図 1に示すように、LVFC をレーザー モジュールに組み立ててサンプルチャンバを作成します。出口管をLVFCの右側のポートに取り付けます。注: 入口と出口チューブは直径が異なり、入口は出口よりも直径が小さくなります。流入口と出口のチューブ接続を交換すると、フローセルを加圧して漏れる原因となる場合があります。 注射器を入口チューブから取り外し、1 mLのろ過水を含む新しいシリンジと交換し、液体と液体の接触を確保します。入口チューブをLVFCの左側のポートに接続します。サンプルチャンバーに約500μLの液体をゆっくりと導入します。負荷時に気泡が発生しないように注意してください。最終的なチューブ構成を 図 2に示します。 図1:レーザーモジュールに取り付けられた低体積フローセルアセンブリ。  図 2: 低ボリューム フロー セルチューブ構成この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 レーザーモジュールのロードとシステムチェック 水を満たしたLVFCを入れ、レーザーモジュールをインストゥルメントに挿入し、ロックします。 注射器をシリンジポンプクレードルに入れ、固定します。ソフトウェアインターフェイスで[カメラを 開始 ]をクリックしてカメラを初期化します。インターフェイスの [ ハードウェア ] タブで、[ スキャッタ ] をクリックして参照位置を移動します。 カメラレベルを 16 に設定し、手動でフォーカスを調整して、パーティクルの希釈剤を確認します。メインの表示ウィンドウを左クリックし、マウスを使用して上下にドラッグしてパーティクルを確認することで、視野の位置を調整します。視野に3つ以上の粒子がある場合、これは水の純度または洗浄プロセスに問題があることを意味し、したがって、洗浄プロセスを繰り返すか、水を交換または濾過する必要があります。 レーザーモジュールを機器から取り外します。 注射器を入口チューブから取り外し、空気のみで満たされた注射器に交換します。サンプルチャンバーに空気をゆっくりと入れて、内部の液体を取り除きます。レーザーモジュールからLVFCを取り外し、チューブを取り外します。LVFCとレーザーモジュールの光学ガラス表面を水で洗浄し、ティッシュと圧縮空気で乾燥させます。チューブを圧縮空気で乾燥させます。LVFCをレーザーモジュールに組み立て直し、チューブを接続してサンプルローディングの準備をします。注: この手順は必ずしも必要とは限りませんが、この場合は、可能性のある変動をさらに減らすための特別な予防措置として追加されました。 サンプルを読み込む ステップ 2.2.2 を繰り返します。ステップ1.1で作られた60nm金ナノ粒子分散液の1mLを含むシリンジをLuerポートに接続します。750 μLのサンプルを、機器の外に見えるレーザーモジュールを使用して、インレットチューブを介してLVFCにゆっくりと注入し、泡が入らないようにします。 レーザーモジュールをNTA計測器にロードし、ソフトウェアインターフェイスの スタートカメラ をクリックしてカメラを初期化します。インターフェイスの [ ハードウェア ] タブで、[ スキャッタ ] をクリックして参照フォーカス位置に移動し、パーティクルの鮮明なイメージを表示するために正しく設定されていることを確認します。 レーザー光の位置に対して視野が中央に設定されていることを確認します。ソフトウェアのメイン表示ウィンドウを左クリックし、上下にマウスをドラッグして、それに応じて調整します。 自動セットアップ機能を実行して、最適な画質を実現するために、フォーカスとカメラレベルを自動的に最適化します。注:自動カメラとフォーカスパラメータは、ユーザーに依存しないため、異なるラボ間でより一貫性を保つことができます。 サンプル分析 標準測定、SOPタブで測定スクリプトを作成し、60sの60の繰り返しビデオを遅く(粒子は画面の一方の側から約10sで他方に渡すべきである)と一定の流れ(補助ファイル1)を得る。注: 測定のためにサンプル全体をより良く表現するためにフローを推奨します。サンプルに遅い流れが与えられると、濃度測定の精度と再現性が大幅に向上し、より多くの新しい粒子が測定ゾーンを流れ、実験中に分析されます。ビデオの長さは、プロファイルの分布と、それが分析時間にわたってどのように変化するかによって異なります。60 sの5つの動画は、典型的な測定時間と考えられています。 データの実験ファイル名と場所を設定し、実行を開始します。概説された手順に続く分析は、Horizon 2020 ACEnanoプロジェクト17の7つの研究所によって行われた。 3. データ分析 注: すべてのデータ分析は v 3.4 ソフトウェア内で行われました ( 材料表を参照) 追加の手動変換や計算は使用されません。粒子サイズデータはヒストグラム分布として生形で提示され、ストークス・アインシュタイン方程式を用いて粒子の位置の測定された変化から計算されます。ソフトウェアは、x および y 平面内の各パーティクルによって移動される平均距離を決定します。この値により、粒子拡散係数(D)を求めることができ、そこから、サンプル温度Tと溶媒粘度ηが既知であれば、等価の球体流体力学的半径、RH、粒子のを算出することができる。サンプルの温度はNTAによって自動的に記録されます。ソフトウェアで使用されるデフォルトのサンプル粘度は水用であり、上記の測定スクリプトに含まれていますが、測定の前後に異なるサンプル希釈剤を使用すると粘度を修正できます。 検出しきい値 (DT) を設定するには、2 ~ 20 の間で、視覚化されたパーティクルの最適な追跡の解析パラメータである[検出しきい値] の下にあるソフトウェアの[+]ボタンと[-]ボタンをクリックします。選択した DT 値が、できるだけ多くの可視パーティクルを識別して追跡していることを確認します(ソフトウェア イメージ画面上で赤い十字として自動的にマークされます)。 検出閾値を設定するためのガイダンスとして、画像内の識別された粒子の数は、観察者によって粒子と見なされない部位に10個以下の赤十字が対応する必要がある約30〜80の範囲にあるべきである。5つ以下の青い十字架(ノイズを示す)が観察されるべきではありません。 図3:しきい値設定観測値不良(左)と良好な検出(右)検出しきい値設定の観測。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 ソフトウェアの[プロセス]ボタンを押して、パーティクルトラッキング解析ビデオを自動的に処理します。すべての処理パラメータを自動に設定したまま、データを.csv形式の結果ファイルとしてエクスポートし、完全なパーティクルサイズ分布と、測定設定を記述する追加のメタデータを使用します。測定品質を確認するには、ソフトウェアの[分析]タブを見るか、警告メッセージまたは警告の出力ファイル.csvを確認します。PDF 結果レポートの例は、補足ファイル 2に示されています。 PDF レポートからモードサイズの結果と関連する標準偏差を読み取ります。注: モードサイズの結果は、7つの研究所の中で得られたサイズを比較するために使用され、セクション5で示され、議論されています。 4. 洗浄と乾燥 使用後、清潔な水でシステムを十分に洗い流し、チューブや光学表面からサンプルの痕跡をすべて取り除きます。洗浄効果は、視野内の粒子の量を観察することによって監視することができる。 NTA機器からレーザーモジュールを取り外します。 システムを通して空気の注射器をロードし、チューブとLVFCを空にします。