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Biochemistry

Separação Mecânica e Solubilização de Proteínas das Subcamadas Perivitelline Externas e Internas dos Ovos de Galinha

Published: January 27, 2021
doi:
10.3791/61739
, ,
1Institut National de Recherche pour l’Agriculture, l’Alimentation et l’Environnement,Université de Tours, Biologie des Oiseaux et Aviculture, 37380, Nouzilly, France

Summary

Este artigo relata um método simples para isolar as subcamadas perivitelline externas e internas de ovos de galinha, minimizando a alteração estrutural e otimizando a solubilização proteica de cada subcamado para análises proteômicas.

Abstract

A camada de perivitelina que circunda a gema de ovo desempenha um papel fundamental na fertilização, na defesa dos óvulos e no desenvolvimento do embrião aviário. É formada por duas subcamadas proteináceas que estão fortemente associadas e formadas por órgãos reprodutivos femininos distintos. Presume-se que ambas as estruturas tenham suas próprias especificidades funcionais, que permanecem a serem definidas. Para caracterizar a função das proteínas que compõem cada subcamhador, o primeiro desafio é estabelecer as condições que permitiriam a separação mecânica dessas duas camadas complexas, limitando qualquer dano estrutural. O segundo passo é otimizar as condições experimentais para facilitar a solubilização proteica dessas duas subcamadas, para análises bioquímicas subsequentes. A eficiência dessa abordagem é avaliada pela análise do perfil proteico de cada subcamada por Sulfato de Sódio-Poli-Acrilamida Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), que deverá ser distinto entre as duas estruturas. Este procedimento em duas etapas permanece simples; requer equipamentos bioquímicos clássicos e reagentes; e é compatível com proteômica mais aprofundada. Também pode ser transposta para outros ovos aviários para biologia comparativa, sabendo que a estrutura e a composição da camada perivitelline tem se mostrado características específicas das espécies. Além disso, as condições de não desnaturação desenvolvidas para a separação de subcamadas (passo 1) permitem suas análises estruturais através da varredura e da microscopia eletrônica de transmissão. Também pode constituir o passo inicial para a posterior purificação de proteínas para analisar suas respectivas atividades biológicas e estrutura 3D, ou para realizar novas análises imunohistoquímicas ou funcionais. Tais estudos ajudariam a decifrar a função fisiológica dessas duas subcamadas, cujas integridades estruturais e funcionais são critérios determinantes do sucesso reprodutivo.

Introduction

O objetivo deste método é fornecer um protocolo que permita a caracterização bioquímica subsequente da camada perivitelline (PL), uma fina camada proteinácea que envolve a gema do ovo e desempenha um papel fundamental na reprodução de espécies aviárias. O PL, também denominado “membrana vitelline” na literatura, é uma rede tridimensional de fibras grossas composta por vários tipos de glicoproteínas. Consiste em uma camada perivitelline interna (IPL) (em contato com a gema) que é montada no ovário, e de uma camada perivitelline externa (OPL, em contato com o branco), deitada no IPL(Figura 1) e produzida pelo infundibulum. Este último tecido é o segmento superior semelhante ao funil do oviduto recebendo o folículo de gema madura após a ovulação, e o local onde a fertilização ocorre. A secreção da OPL ocorre após esses dois eventos e é seguida pelo depósito sucessivo da clara de ovo e da casca de ovo em outros segmentos específicos do oviduto. As funções fisiológicas do PL não estão relacionadas apenas à fertilização e estágios iniciais da embriogênese, mas também à proteção física e molecular do embrião. A análise proteômica do ovo de galinha realizada em todo o PL revelou a presença de 137 proteínas diferentes1,mas a distribuição da maioria dessas proteínas entre IPL e OPL continua a ser elucidada. A quantidade mínima de dados disponíveis no relatório de literatura que IPL e OPL apresentam perfis proteicos muito distintos2,3,4, o que sugere diferentes propriedades estruturais e funcionais. A relativa escassez de dados sobre a distribuição de proteínas entre OPL e IPL é provavelmente devido à dificuldade de separar ambas as subcamadas que são finas e incorporadas.

O método aqui apresentado descreve as condições a serem utilizadas para separar as duas subcamadas com impacto limitado em sua respectiva estrutura histológica, preservando seu conteúdo proteico, e para fornecer o protocolo que permite a solubilização completa das proteínas para posterior análise por proteômica. Inclui dois passos principais: amostragem pl e separação OPL/IPL e 2) TRATAMENTO PL, OPL e IPL para solubilização de proteínas e eletroforese para análise de espectrometria de massa. O fluxo de trabalho é apresentado na Figura 2. Notavelmente, embora o presente protocolo tenha sido otimizado para análises proteômicas (Etapa 2.2), pode ser parado em algumas etapas para a histológica (por exemplo, microscopia eletrônica), análises imunohistoquímicas, estudos funcionais (passo 1) e para purificação de proteínas solúveis em sal, a fim de caracterizar sua estrutura e atividade biológica (etapa 2.1)(Figura 2).

O primeiro passo é a remoção do PL total da gema de ovo (Figura 2, etapa 1.1). Todos os métodos publicados começam com a separação da clara de ovo da gema manualmente ou usando um separador de ovos. É seguido pela remoção da clara de ovo restante e do chalazae grosso usando fórceps ou por adsorção em um papel filtro5 (Figura 2A). Em seguida, as técnicas selecionadas para amostrar PL são variáveis dependendo dos artigos publicados. Alguns artigos incluem várias lavagens da gema, em água desionizada ou destilada1,5,6, em solução salina de 0,85 a 1%2,7,8, em soluções tamponantes como 0,15 M NaCl/N-[Tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetanesulfônico, pH 7.44, ou em 0,01N HCl (pH 2)3. Estes procedimentos foram aplicados em ovos de frango, pato, pescoço a anel, perdizes cinzas, papagaio calopsita, pombo doméstico ou ovos de ratitas2,6,9. A remoção do PL enquanto a gema de ovo é mantida em uma placa de Petri sem soluções aquosas pode ser muito trabalhosa, pois o PL é frágil e a gema de ovo tende a grudar no PL1,5 e, portanto, permanece difícil de eliminar depois. O uso de tampão ácido ou solução por uma hora a 37 °C3 também não é preferido, pois tais condições podem alterar a estrutura pl e podem resultar em perda de proteína. Também é importante remover a área que contém o disco germinal, pois essa zona provavelmente terá um padrão estrutural e molecular distinto, o que não reflete todo o PL4,6,10 ( Figura2B). Este método aproveita ideias destacadas por alguns artigos publicados e propõe algumas melhorias para facilitar a amostragem de PL, preservando sua integridade (Figura 2C).

A segunda etapa consiste em separar as duas subcamadas (Figura 2, etapa 1.2). Este passo é crítico, pois o OPL e o IPL estão firmemente ligados um ao outro. Esta etapa deve ser conduzida cuidadosamente com fórceps sob um microscópio de dissecação binóculo. As publicações que relatam separação OPL/IPL são bastante limitadas2,3,7,11 e algumas delas utilizam condições específicas (tampão ácido a 37 °C para 1 h2,3) que provavelmente afetarão a estrutura histológica das subcamadas e/ou contribuem para a perda de proteínas ou contaminações de gema ou branco. Para distinguir melhor o OPL do IPL, alguns autores relataram o uso do azul toluidina para colorir ligeiramente o OPL (a camada interna permanece incolor)11. No método desenvolvido, otimizamos as condições para que a separação seja facilmente alcançada e não exija o uso de qualquer corante (Figura 2D).

O segundo passo principal é a solubilização das proteínas que compõem cada subcamhador. Classicamente, é conseguido misturando1linófilo limpo, seco2,6, ou recém-preparado3,4,11 PL/subcamadas diretamente com o tampão Laemmli usado para eletroforese. Outros autores preferiram uma solubilização preliminar de camadas em 1% NaCl, em uma solução de tampão SDS de 1%,2,3,11 ou em uma solução contendo inibidores de protease e SDS6 à temperatura ambiente ou Triton seguido de incubação a 45 °C12, sob constante agitação vigorosa. Alguns autores também descreveram um protocolo onde o PL foi incubado em soro fisiológico tampão fosfato ou ureia e submetido à sônica13. Estes tratamentos foram todos seguidos por uma centrifugação e diluição no tampão laemmli e todos compartilham a desvantagem da solubilização proteica incompleta das camadas, pois a matéria insolúvel (a pelota obtida após a centrifugação) é descartada da amostra a ser analisada.

Além disso, o uso de condições de desnaturação (ureia, detergente, alta temperatura, etc.) por certos autores para solubilização proteica não é compatível com a posterior purificação de proteínas para caracterização, pois eles são susceptíveis de inativar irreversivelmente proteínas, interferir em suas atividades biológicas e também prejudicar sua estrutura 3D. Para esta etapa específica 2, o protocolo inclui um primeiro subpasso que permite a solubilização das proteínas mais abundantes em condições não desnaturais após a desestruturação mecânica PL/OPL/IPL, que não interferirão em estudos mais proteicos, se necessário (Figura 2, etapa 2.1), e um segundo subpasso que permite a solubilização completa de proteínas para eletroforese e proteômica em profundidade(Figura 2, passo 2.2). Combina sugestões retiradas de vários artigos publicados e ajustes resultantes de novas ideias validadas por estudos experimentais.

Protocol

Amostras de 1.PL, IPL e OPL Amostragem de PL Quebre o ovo recém-colocado não fertilizado manualmente e use um separador de ovos deitado em um copo de vidro para separar a gema do branco. Remova o chalazae com uma tesoura pequena e role a gema sobre um papel filtro para remover o albumen aderente que aparece como uma estrutura transparente e visível(Figura 2A).ATENÇÃO: Tenha cuidado para não perfurar o PL com uma tesoura. O uso de pinças em vez de tesouras para remover chalazas pode provocar quebra pl e subsequente vazamento de gema. A etapa de rolamento do papel do filtro é crítica e deve ser realizada muito rapidamente devido às propriedades absorventes do filtro de papel que podem desencadear a quebra do PL. Também é muito importante usar um ovo não fertilizado desde o dia da lei, para otimizar o sucesso deste primeiro passo e todas as etapas subsequentes. Alternativamente, podem ser utilizados ovos armazenados há menos de 10 dias em um ambiente resfriado, mas os experimentadores devem considerar os riscos potenciais de alterações de PL. Mergulhe a gema em um cristalizador contendo 10 mM Tris-HCl pH 8 que foi previamente resfriado até 4 °C e remova a área pl sobre o disco germinal dentro de uma zona de 1 cm usando uma tesoura sem corte(Figura 2B).NOTA: Inicialmente, o PL estava imerso em água desionizada, mas essa abordagem tem algumas desvantagens, como a falta de controle de pH e as dificuldades de separar as subcamadas posteriormente (etapa 1.2). Portanto, várias condições foram testadas, incluindo a concentração de Tris(Figura 3A) e o pH(Figura 3B). O uso de um tampão no pH 8, em vez de água deionizada ou desmineralizada, está de acordo com a fisiologia do ovo (o pH da clara de ovo é de cerca de 7,8 no dia do leito)14 e minimiza a perda de proteínas. Em contrapartida, suspeita-se que o pH ácido ou muito alcalino acione a desestruturação do PL e a solubilização precoce da proteína(Figura 3B). O tampão composto por 10 mM Tris-HCl pH 8 foi considerado ótimo, pois respeita a fisiologia do ovo e não causa solubilização proteica significativa (a concentração proteica no tampão de trabalho permanece mínima, Figura 3A,B). Rompa o PL com uma tesoura pequena no tampão. Segure as duas bordas do PL rompido com fórceps e retire o PL da gema. Mantenha o PL com fórceps e enxágue o PL várias vezes em vários banhos de 10 mM Tris-HCl, pH 8 até que nenhum traço de gema seja visível. Nesta fase, certifique-se de que o PL está limpo, branco e flutuando no buffer. Pode ser processado na etapa 1.2 para separação de subcamadas ou diretamente para a etapa 2.1 para análises bioquímicas. Amostragem de OPL e IPL Espalhe toda a amostra pl colocando OPL para cima em uma placa de Petri de plástico e mantendo-a plana com o menor tempo possível. Cubra a amostra com 10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl. Use uma placa de Petri de plástico (e não vidro) para limitar os movimentos de PL, pois pl gruda melhor no plástico. Para localizar o lado OPL, veja onde a localização do chalazae restante está anexada ao OPL e não ao IPL. Esta etapa requer uma pequena concentração de NaCl (50 mM) para facilitar a separação do subcamheiro.NOTA: Com base no gráfico apresentado na Figura 3C e na literatura11,essa concentração não deve levar a uma grande perda de proteína. Inicialmente, a água deionizada foi utilizada para separar as subcamadas, como descrito anteriormente1,5,6, mas essa técnica foi considerada muito trabalhosa e resultou na alteração da integridade estrutural do PL. Portanto, diferentes concentrações de NaCl(Figura 3C) foram testadas, pois o sal facilitou a separação das duas subcamadas. No entanto, vale ressaltar que o uso da concentração de NaCl >100 mM aumenta a solubilização/liberação de proteínas do PL, que não é o objetivo aqui (este será o objetivo na etapa 2) (Figura 3C). Adicionar 50 mM NaCl ao buffer de 10 mM Tris-HCl pH 8 facilita a separação das duas subcamadas e minimiza a perda de proteínas. Corte o PL total em pedaços de cerca de 2 cm x 3 cm com uma tesoura pequena. Separar mecanicamente as duas camadas de cada peça PL com fórceps de ponta ultra-precisos sob um microscópio de dissecação binóculo(Figura 4). Armazene as amostras de IPL e OPL resultantes individualmente em microtubos a -80 °C, até que seja mais utilizado.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Deve-se notar que a eficiência e a facilidade de separação das duas camadas depende muito do frescor do ovo. De fato, os ovos armazenados apresentam modificações internas drásticas devido ao rápido aumento do pH branco de ovo e posterior alteração do índice de gema devido ao afrouxamento (e enfraquecimento do PL). O IPL é mais frágil em comparação com o OPL. É, portanto, preferível colocar a face do OPL acima e separar as duas subcamadas puxando o OPL com os fórceps. Ambas as subcamadas devem ser tratadas com cuidado precioso. 2. Tratamento amostral para solubilização de proteínas e análises de SDS-PAGE Solubilização primária da proteína Amostras de IPL e OPL congeladas individualmente. Uma vez concluída a secagem congelante, corte aproximadamente 1 mg de cada amostra em microtubos limpos que possuam uma tampa de parafuso à prova de vazamento. Mantenha as amostras restantes em tubos bem fechados para armazenamento prolongado a -80 °C.NOTA: O uso de microtubos com tampa de parafuso à prova de vazamento garante o fechamento hermético e à prova de vazamentos para evitar a reidratação da amostra e que irá proteger as amostras. Misture 1 mg de cada subcamada liofilizada com 400 μL de 50 mM Tris pH 7, 500 mM NaCl. Use uma fábrica de misturas por 2 vezes por 5 min a 30 Hz para desintegrar estruturas OPL e OPL em micropartículas e facilitar a solubilização de proteínas. Colete 400 μL das amostras contendo o OPL e o IPL em dois microtubos limpos.NOTA: O tampão utilizado aqui foi escolhido para aumentar a solubilização proteica (ao contrário do passo 1). Este buffer foi baseado nos resultados apresentados na Figura 3, que mostram um aumento na solubilização da proteína no pH 7 (Figura 3B) e utilizando 0,5 M NaCl (Figura 3C). O protocolo pode ser pausado aqui. Nesta fase, as amostras podem ser utilizadas para a purificação proteica das principais proteínas PL ou processadas para a etapa 2.2. Solubilização de proteínas para eletroforese Adicione 5x tampão de amostra SDS-PAGE (100 μL, 0,25 M Tris-HCl, 0,05% azul bromofenol, 50% glicerol, 5% SDS, 5% beta-mercaptoetanol, pH 6,8) a cada 400 μL da amostra e calor a 100 °C para 5 min.NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, e as amostras podem ser armazenadas a -80 °C. Nesta fase do protocolo, OPL e IPL estão completamente dissolvidos. A eficiência da solubilização amostral pode ser avaliada por amostras centrifugadoras por 5 min a 10.000 x g. A solubilização completa é caracterizada pela ausência de pelota visível após a centrifugação. Assim, após a solubilização completa, considera-se aqui que 1 mg de subcamada liofilizada corresponde a 1 mg de proteínas (a concentração proteica na amostra de 500 μL é de 2 mg/mL). De fato, o PL é composto por mais de 80% de proteína2,15. O uso de um buffer de amostra de 5x limita a diluição amostral, mas um buffer de amostra de 1x ou 2x também pode ser usado. Carregue um máximo de 20 μg de proteínas/pista em um gel de poliacrilamida SDS (gel de 4%-20% gradiente) e realize eletroforese a 120 V usando um sistema de eletroforese vertical.NOTA: O uso de um gel de gradiente de 4%-20% não é obrigatório, mas é preferível aqui como OPL e IPL exibem proteínas com pesos moleculares que variam de 250 kDa. Também pode ser útil manter o gel de empilhamento (que geralmente é removido), pois a presença de proteínas insolúveis ou agregados proteicos na parte inferior dos poços indicaria má solubilização e um possível passo perdido durante a preparação da amostra. Após a eletroforese, remova os géis das placas de vidro e colora com a solução Coomassie Brilliant Blue (50% H2O, 40% EtOH, ácido acético 10% e R250 Coomassie Azul Brilhante) por 30 min. Destalar com uma solução composta por 50% H2O, 40% EtOH, solução de ácido acético de 10% até que o fundo do gel pareça azul claro. Por fim, transfira o gel em pratos de Petri contendo água deionizada, para conseguir a des coloração e reidratação de géis de poliacrilamida. As proteínas devem aparecer como faixas azuis de fundo transparente.

Representative Results

OPL e IPL foram separados do PL de um ovo recém-colocado não fertilizado para analisar seus perfis proteicos pela SDS-PAGE. O fluxo de trabalho experimental de todo o protocolo é ilustrado na Figura 2. A Figura 3 mostra a liberação de proteínas em diferentes concentrações tris(Figura 3A),vários pH(Figura 3B) e diferentes concentrações de NaCl(Figura 3C). As duas subcamadas resultantes foram observadas sob a luz do microscópio de dissecação binóculo e são mostradas na Figura 4, onde o IPL é translúcido, enquanto o OPL é denso, nublado e esbranquiçado. Essas características podem testemunhar em parte a eficiência da separação do subcamhador. Após a separação, OPL e IPL foram liofilizados de forma independente, e seu teor de proteína foi completamente dissolvido graças a uma combinação de moagem mecânica, o uso de um detergente aniônico (SDS) e um agente redutor (beta-mercaptoetanol), seguido de ebulição. Após a migração em um gel de poliacrilamida (eletroforese SDS-PAGE), as amostras OPL e IPL exibem perfis eletroforéticos distintos(Figura 5),como esperado. Figura 1: Estrutura do PL de um ovo recém-colocado não fertilizado. Micrografo de microscopia eletrônica de transmissão e transmissão de todo o PL em seção transversal (dados pessoais, ©Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique, University e CHRU of Tours, França, S. Georgeault). Note-se que este quadro foi obtido a partir de PL elaborado como apresentado neste protocolo. OPL, camada perivitelline externa; IPL, camada perivitelline interna. A ponta da flecha preta indica a membrana contínua que separa as duas subcamadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Fluxo de trabalho resumindo as duas etapas principais do protocolo e exemplos de aplicações. O protocolo foi otimizado para análise proteômica das camadas pl, mas pode ser interrompido em algumas etapas para outras aplicações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Otimização da composição tampão para amostragem de PL. Resumidamente, o PL limpo (n = 4) foi incubado no mesmo volume das várias soluções tampão por 2 h.PL foi removido, e a concentração proteica foi estimada medindo a absorvência em 280 nm no buffer restante. (A) Efeito da concentração de Tris-HCl no pH 8. (B) Efeito do pH (7 a 9). (C) Efeito da concentração de NaCl. A partir desses resultados, concluímos que o buffer composto por 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM NaCl é o mais apropriado, pois limita a perda de proteínas. Os resultados são expressos como um desvio padrão ± médio de quatro amostras pl diferentes. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se um ANOVA unidirecional seguido de um teste de comparações múltiplas de Tukey. O valor P <0,05 foi considerado significativo (ns, não significativo; * p<0,05, *** p<0,001, **** p<0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Características OPL e IPL sob um microscópio de dissecação binóculo. Após a separação, iPL (à direita) parecia translúcido e OPL (à esquerda) era opaco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Análise SDS-PAGE de OPL e IPL separados de ovo não fertilizado recém-colocado. 4%-20% gel de acrilamida seguido por Coomassie brilhante mancha azul. A massa de bandas padrão de peso molecular é indicada em kDa. O perfil OPL composto principalmente de proteínas com massa molecular >30 kDa enquanto as principais bandas detectadas no perfil IPL têm massas moleculares <30 kDa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O sucesso do presente protocolo conta com duas etapas críticas que foram otimizadas de forma independente: a separação mecânica de OPL e IPL que precisam ser o menos desestruturadoras possível, seguidas pela solubilização completa da proteína de cada subcamada, que é, inversamente, desestruturação e desnaturação. Também destaca alguns pontos específicos que precisam ser levados em consideração para garantir o sucesso de cada etapa.

O protocolo não depende da cor da casca de ovo, do peso do ovo, do tipo de produção ou da cepa genética da galinha. No entanto, depende do frescor do ovo. De fato, o ovo sofre profundas modificações físicas internas rapidamente após ser colocado, embora essas alterações possam ser quando o armazenamento é realizado sob condições refrigeradas14,15. A perda de dióxido de carbono através dos poros de casca de ovo durante o armazenamento resulta no aumento do pH branco de ovo (de 7,8 para 9,5) enquanto algumas trocas de água ocorrem entre a gema e a branca, através do PL. Ambas as modificações impactam negativamente a estrutura molecular e histológica do PL que se enfraquece e menos tensa14,15, provavelmente devido a modificações fisicoquímicas de seu teor proteico16,17,18. Supõe-se que a separação de subcamadas se tornará muito difícil com ovos armazenados especialmente se o armazenamento for realizado por um longo período à temperatura ambiente. Atualizado, o protocolo foi realizado utilizando ovos armazenados por menos de 4 dias a 4 °C e ainda não se sabe a duração máxima do armazenamento de um ovo para provar eficientemente as subcamadas PL. Além disso, se o objetivo é a análise de cada subcamada, é crucial o uso de ovos não fertilizados. No dia da lei, o embrião de um óvulo fertilizado tem 23h de idade e seu desenvolvimento é muito rápido depois, se o ovo for incubado. De fato, o desenvolvimento embrionário e o crescimento de algumas estruturas extraembrínicas expandem-se usando PL como substrato, que é, portanto, rapidamente degradado, e substituído pelo saco de gema extraembriônica19.

Após a separação manual da gema e da clara de ovo, a gema precisa ser limpa a partir de traços brancos de ovo e de chalazae que permaneceu firmemente presa ao PL. A dica é enrolar a gema cuidadosamente em um papel filtro e realizar lavagens extensas da gema em soluções tamponadas (10 mM Tris-HCl pH 8). O pH utilizado para o tampão é consistente com o pH fisiológico da clara de ovo14 e tem sido mostrado para minimizar a perda de proteína(Figura 3). O uso de um tampão refrigerado ajudará a remover o PL da gema, pois a 4 °C, o buffer facilitará a remoção do PL à medida que a gema lipídica se retrai e se torna menos fluida a esta temperatura. Lavagens adicionais permitirão a remoção de resíduos de gema do PL. Também é importante cortar a zona correspondente ao disco germinal porque essa estrutura que contém pronucleus feminino pode não ser representativa do PL. É o local de fertilização e multiplicação das células embrionárias quando o óvulo é fertilizado. É suposto ter uma composição particular que pode não ser representativa de todo o PL, razão pela qual foi removido. Esta etapa específica é fortemente facilitada quando a gema está imersa em um tampão frio. Embora essa estrutura de disco germinal esteja descartada no presente protocolo (fora dos objetivos), análises específicas dessa área em ovos fertilizados podem ser muito úteis para cientistas interessados em estudar a evolução do conteúdo PL (proteômica e atividade) e estrutura (microscopia eletrônica), durante os estágios iniciais da embriogênese19,20,21. Nesta fase, todo o PL está estruturalmente intacto e pode ser processado para análise estrutural posterior por microscopia eletrônica(Figura 2),para a etapa 1.2 ou para a etapa 2.1 (se o objetivo é analisar todo o PL).

O passo 1.2 precisa ser conduzido sob um microscópio de dissecação binóculo, pois o PL é muito fino e frágil (cerca de 10 μm de espessura). A separação de subcamadas é quase impossível na água ou no tampão sem sal mínimo, e as tentativas iniciais usando essas opções resultaram em sérios danos pl. Assim, o tampão selecionado para esta etapa permanece em pH fisiológico (pH 8) e contém 50 mM NaCl. Esta etapa é árdua e deve ser realizada com cuidado e cuidado para evitar o rasgo do PL. Uma vez separados, as duas subcamadas podem ser facilmente identificadas, pois exibem características físicas peculiares (opaca versus translúcida). A falta de homogeneidade do IPL sob a luz do microscópio deve refletir uma separação incompleta e, portanto, a presença dos pontos remanescentes de OPL presentes no IPL. Além disso, é muito difícil tratar toda a membrana e o uso de peças de 2 cm x 3 cm aumenta muito as chances de sucesso. A subcamada resultante obtida é adequada para estudo histológico por microscopia eletrônica(Figura 1). Vale ressaltar que uma estrutura linear específica (0,05 a 1 μm de espessura) chamada membrana contínua (CM) é visível no micrografo (Figura 1) e permanece geralmente ligada a uma ou outra subcamada durante o processo de separação. Foi publicado anteriormente que, ao usar uma molaridade de sal relativamente alta para separação (500 mM), o CM permaneceu ligado ao OPL7, enquanto o uso da água5 favorecerá a fixação de CM ao IPL. Neste protocolo, uma baixa molaridade salgada é usada para atingir os objetivos específicos (subcamada PL estruturalmente intacta e perda mínima de proteínas), o que significa que este CM provavelmente está associado ao IPL. No entanto, análises adicionais de IPL e OPL por microscopia eletrônica de transmissão diriam claramente sobre essa hipótese. As camadas PL, OPL ou IPL obtidas no final da etapa 1 também podem ser utilizadas para ensaios in vitro para análises de ligação espermatozoides-óvulos22 ou para analisar os primeiros passos do desenvolvimento embrionário23,24.

O passo 2 refere-se à solubilização do teor proteico, parcialmente (etapa 2.1) ou completamente (etapa 2.2). PL e/ou OPL são primeiro liofilizados para remover moléculas de água e permitir medições precisas de peso. De fato, o PL é composto principalmente por água (88%)7, enquanto a matéria seca contém essencialmente proteínas (80% a 90% dependendo de estudos), carboidratos, gorduras e minerais2,7,25. Considerando que a água contida no PL é removida por congelamento de secagem, que os carboidratos são essencialmente recuperados em pl glicoproteínas, e que gordura e minerais originários da gema são essencialmente descartados por lavagem extensiva, presume-se que o PL resultante é composto quase exclusivamente de proteínas. Assim, o valor de peso obtido após a liofilização completa deve corresponder principalmente às proteínas. A quantidade igual de PL, OPL e/ou IPL são então diluídas no buffer contendo 0,5 M NaCl. A alta molaridade salgada combinada com a destruição mecânica da rede fibrosa pela moagem facilita muito a solubilização proteica em condições de não desnaturação. Esta etapa é seguida pela solubilização completa usando ebulição, detergente SDS e o agente redutor beta-mercaptoetanol (passo 2.2). De fato, algumas proteínas IPL são glicoproteínas solúveis em SDS25,26,27 e os principais constituintes do OPL são NaCl-solúvel1,11. Usando este protocolo, não vimos nenhuma pelota remanescente de proteínas insolúveis após a centrifugação, o que indica que a solubilização estava provavelmente completa. As proteínas de PL, OPL e/ou IPL foram então analisadas pelo SDS-PAGE. Os perfis proteicos resultantes são consistentes com a literatura publicada2,4,11,16, mas a resolução e intensidade do sinal é altamente melhorada e muito mais homogênea entre várias amostras independentes de IPL e OPL.

Além disso, a comparação quantitativa entre OPL e IPL é possível graças à precisão do peso que inferimos para as respectivas subcamadas2,7. Além disso, ambos os perfis OPL e IPL são muito distintos e, exceto uma faixa fraca a 14 kDa e 75 kDa, ambas as subcamadas PL não compartilham visivelmente bandas exibindo o mesmo peso molecular. Esta observação corrobora a eficiência da separação de subcamadas sem contaminação cruzada significativa. De acordo com a única análise proteômica PL publicada1, as bandas mais intensas em OPL (30 kDa) são provavelmente a proteína Zona-Pellucida 1 (102 kDa) e a proteína Zona-Pellucida 3 (47 kDa). A distribuição das proteínas PL muito abundantes ovotransferrina (78 kDa), proteína relacionada ao ovalbumin X (45 kDa), ovalbumin (43 kDa)1 entre subcamadas permanece a ser elucidada. De fato, o alto peso molecular dessas proteínas (>30 kDa) sugere que são proteínas IPL baseadas no perfil SDS-PAGE, mas sua especificidade tecidual (proteínas expressas por oviduto) prefere associar essas proteínas a OPL28,29. Além disso, alguns sugeriram uma contaminação potencial de amostras de PL por proteínas de clara de ovo e gema de ovo devido a lavagem insuficiente1. Essa falta de informação é a base para o desenvolvimento do presente protocolo, que será ainda mais utilizado para proteômica quantitativa aprofundada de PL, OPL e IPL.

Alternativamente, a partir da etapa 2.1 e após a centrifugação para remover a matéria insolúvel, é possível extrair algumas proteínas específicas para maior caracterização bioquímica e biológica. Tal abordagem foi recentemente aplicada para caracterizar as atividades biológicas e/ou a estrutura 3D dos dois principais componentes do OPL, a proteína da camada externa da membrana vitelina 1 (VMO1) e a beta-defensina aviária 11 (AvBD11)30,31. A disponibilidade dessas proteínas como moléculas purificadas também pode ajudar a produzir anticorpos específicos para experimentos adicionais, como a imunohistoquímica ou para o desenvolvimento de ensaios quantitativos, incluindo ensaios imunossorentes ligados à enzima.

As duas principais limitações deste protocolo são (1) o desafio com a separação de subcamadas, especialmente se os ovos foram armazenados mais de 4 dias a 4°C e (2) o fato de que a solubilização completa da proteína requer redução e desnaturação de tampões, que prejudicam a atividade biológica intrínseca das amostras resultantes. Em relação à primeira limitação, a separação mecânica requer habilidades técnicas, mas é facilmente alcançada após 2 ou 3 treinamentos experimentais. Algumas pequenas peças IPL podem permanecer anexadas ao OPL e vice-versa, pois ambas as subcamadas estão fortemente associadas. No entanto, a contaminação de uma subcamadas pela outra deve ser mínima se a separação mecânica for realizada com cautela. Perfis típicos de IPL e OPL SDS-PAGE após a separação ideal do subcamado são ilustrados na Figura 5. Em relação à segunda limitação, as etapas experimentais apresentadas neste artigo foram otimizadas para análises proteômicas, a fim de fornecer uma exaustiva lista de proteínas que compõem cada subcamheira. Para maior caracterização das atividades biológicas de cada proteína, é necessário parar na etapa 2.1.2, antes de utilizar condições de desnaturação (etapa 2.2.1, uso de tampão com SDS e beta-mercaptoetanol seguido de ebulição). No entanto, vale ressaltar que as proteínas resultantes da etapa 2.1.2 são apenas proteínas solúveis em sal, enquanto proteínas sal-insolúveis formam agregados. Uma opção para avaliar ainda mais sua respectiva atividade pode ser produzir proteínas insolúveis em sal como proteínas recombinantes usando sistemas heterologos(E. coli, baculovírus, levedura, etc.).

Este protocolo pode ser adaptado a outros ovos aviários para estudos comparativos para apreciar melhor a originalidade de cada espécie. De fato, o PL exibe algumas especificidades de aves, tanto estruturalmente quanto em termos de composição proteica, provavelmente devido à adaptação a novos ambientes, mas também às especificidades do desenvolvimento2,6,9,32. O desenvolvimento deste protocolo que exige tecnologia moderada e equipamentos/materiais clássicos abre novas vias de pesquisa no campo dos estudos de reprodução e especiação de aves.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Somos gratos a Philippe Didier e Karine Anger (INRAE, PEAT, 37380, Nouzilly, França, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) por fornecer ovos isa-marrom não fertilizados. Agradecemos também à Universidade de Tours, frança, por financiar o Doutorado de M. Bregeon. Este trabalho recebeu apoio financeiro da Agência Nacional de Pesquisa francesa (EQLIPSE, ANR-19-CE21-0006).

Materials

Binocular dissecting microscope Vision Engineering, France Model Mantis Elite
Lyophilizer Cryotec, France Model Cosmos 80
Mini-Protean II electrophoresis cell Biorad, Hercules, USA 1652960 Any apparatus adapted for protein electrophoresis
Mixer Mill MM400 Retsch, Hann, Germany 20.745.0001 Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample
Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm Dutscher, Brumath 5066
Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm Dutscher, Brumath 327005
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Bregeon, M., Guyot, N., Réhault-Godbert, S. Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen’s Eggs. J. Vis. Exp. (167), e61739, doi:10.3791/61739 (2021).
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