الفصل الميكانيكية والسولوبيلية البروتين من الطبقات الفرعية Perivitelline الخارجي والداخلي من البيض الحنة

يعتمد نجاح هذا البروتوكول على خطوتين حاسمتين تم تحسينهما بشكل مستقل: الفصل الميكانيكي لـ OPL و IPL اللذين يجب أن يكونا أقل قدرًا ممكنًا من الهيكلة ، يليه سولوبيليسيلون البروتين الكامل لكل طبقة فرعية ، والذي هو ، على العكس من ذلك ، de-structuring و denaturing. كما يسلط الضوء على بعض النقاط المحددة التي ينبغي أخذها في الاعتبار لضمان النجاح في إنجاز كل خطوة.

البروتوكول لا يعتمد على لون قشر البيض، وزن البيض، نوع الإنتاج، أو سلالة وراثية من hen. ومع ذلك، فإنه يعتمد على نضارة البيض. في الواقع، البيض يخضع تعديلات عميقة الفيزيائية الداخلية بسرعة بعد وضعها، على الرغم من أن هذه التغييرات يمكن أن تتأخر عندما يتم تنفيذ التخزين في ظروف مبردة^14،15. فقدان ثاني أكسيد الكربون من خلال مسام قشر البيض أثناء التخزين يؤدي إلى زيادة درجة PH بياض البيض (من 7.8 إلى 9.5) في حين أن بعض تبادل المياه تحدث بين صفار والأبيض، عبر PL. كلا التعديلات تؤثر سلبا على التركيب الجزيئي والهزلولوجي لل PL التي تصبح ضعيفة وأقل توترا^14,15, من المرجح بسبب التعديلات الفيزيائية الكيميائية من محتواها البروتين^16,17,18. ومن المفترض أن فصل الطبقات الفرعية سوف تصبح صعبة للغاية مع البيض المخزنة خاصة إذا تم تخزين لفترة طويلة في درجة حرارة الغرفة. حتى الآن، تم تنفيذ البروتوكول باستخدام البيض المخزنة لمدة تقل عن 4 أيام في 4 درجة مئوية والمدة القصوى للتخزين لبيضة لعينة بكفاءة PL sublayers غير معروف حتى الآن. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان الهدف هو تحليل كل طبقة فرعية ، فمن الأهمية بمكان استخدام البيض غير المخصب. في يوم الاستلقاء ، يكون جنين البويضة المخصبة 23 ساعة من العمر وتطوره سريعًا جدًا بعد ذلك ، إذا تم احتضان البويضة. في الواقع ، والتنمية الجنينية ونمو بعض الهياكل خارج استخدام PL باعتبارها substratum ، والتي هي بالتالي المتدهورة بسرعة ، ويحل محلها خارج¹⁹sac الصفار خارج مmbryonic.

بعد فصل يدوي من صفار البيض والأبيض، صفار يحتاج إلى تنظيفها من آثار بياض البيض ومن chalazae التي ظلت تعلق بإحكام على PL. الطرف هو لفة صفار بعناية على ورقة مرشح وتنفيذ يغسل واسعة من صفار في حلول المخزنة (10 mM تريس-HCl 8 pH). درجة حُكّة الاضاءة المستخدمة في المخزن المؤقت تتسق مع درجة الهزّة الفيزيولوجية لبيضة بياض¹⁴ وقد ثبت أنها تقلل من فقدان البروتين(الشكل 3). استخدام عازلة المبردة ثم يساعد على إزالة PL من صفار لأنه في 4 درجة مئوية، فإن العازلة تسهيل إزالة PL كما صفار الدهون يتراجع ويصبح أقل السوائل في هذه الدرجة. وسوف يغسل إضافية تسمح لإزالة بقايا صفار من PL. ومن المهم أيضاً أن تُقطع المنطقة المقابلة للقرص الجرثومي لأن هذا الهيكل الذي يحتوي على البروتوكلات الأنثوية قد لا يكون ممثلاً للـ PL. وهو موقع الإخصاب وتكاثر الخلايا الجنينية عندما يتم تخصيب البويضة. ومن المفترض أن يكون لها تكوين معين التي قد لا تكون ممثلة لPL كله، وهذا هو السبب في إزالته. ويسهل هذه الخطوة المحددة بقوة عندما يتم مغمورة صفار في عازلة الباردة. على الرغم من أن هذا هيكل القرص الجرثومي يتم التخلص منه في هذا البروتوكول (من الأهداف)، فإن التحليلات المحددة لهذه المنطقة في البويضات المخصبة يمكن أن تكون مفيدة جدا للعلماء المهتمين بدراسة تطور محتوى PL (البروتيوميات والنشاط) والهيكل (المجهر الإلكتروني)، خلال المراحل المبكرة من تكوين الجنين^19،20،21. في هذه المرحلة، PL كله هو سليم هيكليا ويمكن معالجتها لمزيد من التحليل الهيكلي عن طريق المجهر الإلكتروني(الشكل 2)،إلى الخطوة 1.2 أو إلى الخطوة 2.1 (إذا كان الهدف هو تحليل PL كله).

الخطوة 1.2 يجب أن يتم تحت منظار تشريح المجهر، كما PL رقيقة جدا وهشة (حوالي 10 ميكرومتر سميكة). فصل الطبقات الفرعية يكاد يكون من المستحيل في المياه أو في العازلة تفتقر إلى الحد الأدنى من الملح، والمحاولات الأولية باستخدام هذه الخيارات قد أسفرت عن أضرار PL خطيرة. وبالتالي، فإن العازلة المختارة لهذه الخطوة لا تزال في السّكّر الفيزيولوجي (pH 8) وتحتوي على 50 mM NaCl. هذه الخطوة شاقة ويجب أن يتم تنفيذها بعناية وبلطف لمنع تمزق PL. وبمجرد فصلهما، يمكن التعرف بسهولة على الطبقات الفرعية لأنهما تظهران سمات مادية غريبة (معتمة مقابل شفافة). وينبغي أن يعكس عدم تجانس الألغام المضادة للأفراد تحت ضوء المجهر فصلاً ناقصاً وبالتالي وجود البقع المتبقية من الـ OPL الموجودة على IPL. بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب جداً علاج الغشاء بأكمله ، كما أن استخدام قطع 2 سم × 3 سم يعزز إلى حد كبير فرص النجاح. الطبقة الفرعية الناتجة التي تم الحصول عليها مناسبة للدراسة النسيجية عن طريق المجهر الإلكتروني (الشكل 1). ومن الجدير بالذكر أن بنية خطية محددة (0.05 إلى 1 ميكرومتر سميكة) تسمى الغشاء المستمر (CM) مرئية على micrograph(الشكل 1)وتبقى عادة تعلق على طبقة فرعية واحدة أو أخرى أثناء عملية الفصل. وقد سبق أن نشرت أنه عند استخدام المولى الملح عالية نسبيا لفصل (500 mM)، ظلت اللجنة تعلق على OPL⁷ في حين أن استخدام المياه⁵ سوف تفضل مرفق CM إلى IPL. في هذا البروتوكول، يتم استخدام مُلَلَمٍ منخفض للملح لتحقيق أهداف محددة (الطبقة الفرعية PL سليمة هيكلياً والحد الأدنى من فقدان البروتينات)، مما يعني أن هذا CM من المرجح أن يرتبط بـ IPL. ومع ذلك، فإن تحليل إضافي لـ IPL و OPL عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال سيوضح بوضوح على هذه الفرضية. PL، OPL، أو طبقات IPL التي تم الحصول عليها في نهاية الخطوة 1 قد تستخدم أيضا لم مقايسات في المختبر للبويضة الحيوانات المنوية ملزمة التحليلات²² أو لتحليل الخطوات المبكرة للتنمية الجنينية^23,24.

تشير الخطوة 2 إلى اضمح جزء من محتوى البروتين (الخطوة 2.1) أو كلياً (الخطوة 2.2). PL و / أو OPL هي أول مزيل لإزالة جزيئات الماء والسماح لقياسات الوزن دقيقة. في الواقع، وPL تتكون أساسا من الماء (88٪)⁷، في حين أن المادة الجافة تحتوي على البروتينات أساسا (80٪ إلى 90٪ اعتمادا على الدراسات)، والكربوهيدرات والدهون والمعادن^2،7،25. وبالنظر إلى أن المياه الواردة في PL تتم إزالتها عن طريق تجميد التجفيف، أن يتم استرداد الكربوهيدرات أساسا في البروتينات الجليكوبروتين PL، وأن الدهون والمعادن تنشأ من صفار يتم التخلص منها أساسا من قبل يغسل واسعة النطاق، ومن المفترض أن PL الناتجة تتكون حصرا تقريبا من البروتينات. وهكذا، ينبغي أن قيمة الوزن التي تم الحصول عليها بعد التجميل الكامل تتوافق أساسا مع البروتينات. ثم يتم تخفيف كمية متساوية من PL و/أو OPL و/أو IPL في المخزن المؤقت الذي يحتوي على 0.5 M NaCl. ارتفاع الملح الضرس جنبا إلى جنب مع التدمير الميكانيكية للشبكة الليفية عن طريق طحن يسهل إلى حد كبير solubilization البروتين في ظل ظروف غير denaturing. ويتبع هذه الخطوة من قبل solubilization كاملة باستخدام الغليان، المنظفات SDS وكيل الحد بيتا mercaptoethanol (الخطوة 2.2). في الواقع، بعض البروتينات IPL هي SDS قابل للذوبان glycoproteins^25،26،27 والمكونات الرئيسية لل OPL هي NaCl للذوبان^1،11. باستخدام هذا البروتوكول، لم نر أي بيليه المتبقية من البروتينات غير قابلة للذوبان بعد الطرد المركزي، مما يشير إلى أن solubilization كان من المرجح أن تكون كاملة. ثم تم تحليل البروتينات من PL و OPL و / أو IPL من قبل SDS-PAGE. ملامح البروتين الناتجة تتفق مع الأدب المنشور^2,4,11,16, ولكن دقة وكثافة الإشارة تحسنت بشكل كبير وأكثر من ذلك بكثير متجانسة بين مختلف IPL و OPL عينات مستقلة.

وبالإضافة إلى ذلك، يتم إجراء المقارنة الكمية بين OPL و IPL ممكن بفضل دقة الوزن الذي نحن يستنتج للطبقات الفرعية المعنية^2،7. وعلاوة على ذلك، كل من OPL و IPL ملامح متميزة جدا وباستثناء الفرقة خافت في 14 كيلو ندى و 75 كيلو ادا، كلا PL الطبقات الفرعية لا تشارك بشكل واضح العصابات عرض نفس الوزن الجزيئي. وهذه الملاحظة تؤكد كفاءة فصل الطبقات الفرعية دون وجود تلوث متقاطع كبير. وفقا لتحليل PL البروتيومي الوحيد المنشور¹، فإن أكثر النطاقات كثافة في OPL ( 30 كيلو Da) هي على الأرجح زونا-Pellucida البروتين 1 (102 كيلو داد) وزونا-Pellucida البروتين 3 (47 كيلوDa). توزيع البروتينات PL وفيرة جدا ovotransferrin (78 كيلوDa), البيضويومين البروتين X (45 كيلوتم), ovalbumin (43 كيلو ادا)¹ بين الطبقات الفرعية لا يزال يتعين توضيحه. في الواقع، فإن الوزن الجزيئي العالي لهذه البروتينات (>30 كيلو Da) يشير إلى أنها بروتينات IPL على أساس ملف SDS-PAGE، ولكن خصوصيتها في الأنسجة (البروتينات التي تعبر عنها oviduct) تفضل ربط هذه البروتينات بـ OPL^28،29. وعلاوة على ذلك، اقترح البعض تلوث محتمل لعينات PL عن طريق البيض البيض والبروتينات صفار البيض بسبب عدم كفاية الغسيل¹. وهذا النقص في المعلومات هو الأساس لوضع هذا البروتوكول، الذي سيُستخدم كذلك في البروتيومات الكمي المتعمق للبروتيوميات PL و OPL و IPL.

بدلاً من ذلك، من الخطوة 2.1 وبعد الطرد المركزي لإزالة المادة غير القابلة للذوبان، من الممكن استخراج بعض البروتينات المحددة لمزيد من التوصيف البيولوجي الكيميائي الحيوي. وقد تم مؤخرا تطبيق هذا النهج لتوصيف الأنشطة البيولوجية و / أو هيكل 3D من العنصرين الرئيسيين من OPL، وغشاء vitelline غشاء الخارجي بروتين الطبقة 1 (VMO1) وطيران بيتا defensin 11 (AvBD11)^30،31. قد يساعد توفر هذه البروتينات كجزيئات منقّعة أيضًا على إنتاج أجسام مضادة محددة لإجراء تجارب إضافية مثل الكيمياء المناعية أو لتطوير التشخيضات الكمية، بما في ذلك التشخيض المناعي المرتبط بالإنزيمات.

القيدان الرئيسيان لهذا البروتوكول هما (1) التحدي مع فصل الطبقات الفرعية خاصة إذا تم تخزين البيض أكثر من 4 أيام في 4 درجات مئوية و (2) حقيقة أن ال solubilization البروتين الكامل يتطلب تقليل و denaturing المخازن المؤقتة ، والتي تضعف النشاط البيولوجي الجوهري للعينات الناتجة. وفيما يتعلق بالحد الأول، يتطلب الفصل الميكانيكي مهارات تقنية ولكن من السهل تحقيقه بعد 2 أو 3 دورات تدريبية تجريبية. قد تبقى بعض القطع الصغيرة IPL تعلق على OPL والعكس بالعكس حيث ترتبط كل من الطبقات الفرعية بإحكام. ومع ذلك، ينبغي أن يكون تلوث طبقة فرعية واحدة من قبل الآخر الحد الأدنى إذا تم تنفيذ الفصل الميكانيكي بحذر. نموذجي IPL و OPL SDS-PAGE ملفات تعريف بعد الفصل الأمثل sublayer موضحة في الشكل 5. فيما يتعلق بالتقييد الثاني، تم تحسين الخطوات التجريبية المعروضة في هذه المقالة لتحليلات البروتيوم، من أجل تقديم قائمة شاملة من البروتينات التي تؤلف كل طبقة فرعية. لمزيد من توصيف الأنشطة البيولوجية لكل بروتين، من الضروري التوقف عند الخطوة 2-1-2، قبل استخدام شروط الوَسْل (الخطوة 2-2-1، استخدام العازلة مع SDS وبيتا-ميركابتولينول متبوعاً بالغليان). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن البروتينات الناتجة عن الخطوة 2.1.2 هي فقط البروتينات القابلة للذوبان في الملح في حين أن البروتينات غير القابلة للذوبان تشكل مجاميع. قد يكون أحد الخيارات لمواصلة تقييم نشاط كل منها هو إنتاج بروتينات غير قابلة للذوبان كملح البروتينات المؤتلفة باستخدام أنظمة غير مغايرة(E. القولونية، عصيولفيروس، الخميرة، الخ).

ويمكن تكييف هذا البروتوكول مع بيض الطيور الأخرى لإجراء دراسات مقارنة لتقدير أصالة كل نوع على نطاق أفضل. في الواقع، PL يعرض بعض خصائص الطيور سواء هيكليا ومن حيث تكوين البروتين، من المرجح أن بسبب التكيف مع بيئات جديدة ولكن أيضا إلى الخصوصيات التنموية^2،6،9،32. تطوير هذا البروتوكول الذي يتطلب تقنية معتدلة والمعدات / المواد الكلاسيكية يفتح آفاقا بحثية جديدة في مجال تكاثر الطيور ودراسات تحديد المواصفات.