JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Dış ve İç Perivitellin Sublayerlerinin Tavuk Yumurtalarından Mekanik Ayrıştırılması ve Protein Solubilizasyonu

Published: January 27, 2021
doi:
10.3791/61739
, ,
1Institut National de Recherche pour l’Agriculture, l’Alimentation et l’Environnement,Université de Tours, Biologie des Oiseaux et Aviculture, 37380, Nouzilly, France

Summary

Bu makalede, yapısal değişimi en aza indirirken tavuk yumurtalarının dış ve iç perivitelline alt katmanlarını izole etmek ve proteomik analizler için her bir alt katmandaki protein çözünürlüğünü optimize etmek için basit bir yöntem rapor edilmektedir.

Abstract

Yumurta sarısını çevreleyen perivitelline tabakası döllenmede, yumurta savunmasında ve kuş embriyosunun gelişiminde temel bir rol oynar. Sıkı bir şekilde ilişkili olan ve farklı kadın üreme organları tarafından oluşturulan iki proteinasöz sublayer tarafından oluşturulur. Her iki yapının da tanımlanmaya devam eden kendi işlevsel özelliklerine sahip olduğu varsayılır. Her alt katmanı oluşturan proteinlerin işlevini karakterize etmek için, ilk zorluk, herhangi bir yapısal hasarı sınırlarken, bu iki karmaşık katmanın mekanik olarak ayrılmasına izin verecek koşulları belirlemektir. İkinci adım, sonraki biyokimyasal analizler için bu iki alt katmandan protein çözünürlüğü kolaylaştırmak için deneysel koşulları optimize etmektir. Bu yaklaşımın etkinliği, iki yapı arasında farklı olması beklenen Sodyum Dodecyl Sülfat-Poli-Akrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE) tarafından her bir alt katmanın protein profili analiz edilerek değerlendirilir. Bu iki adımlı yordam basit kalır; klasik biyokimyasal ekipman ve reaktifler gerektirir; ve daha derinlemesine proteomik ile uyumludur. Perivitelline tabakasının yapısının ve bileşiminin türlere özgü özelliklere sahip olduğunun gösterildiğini bilerek, karşılaştırmalı biyoloji için diğer kuş yumurtalarına da aktarılabilir. Ayrıca alt katmanların ayrılması için geliştirilen denatüre olmayan koşullar (adım 1) elektron mikroskopisini tarayarak ve ileterek yapısal analizlerini sağlar. Ayrıca, ilgili biyolojik faaliyetlerini ve 3B yapılarını analiz etmek veya daha fazla immünohistokimyasal veya fonksiyonel analiz yapmak için sonraki protein saflaştırması için ilk adımı teşkil edebilir. Bu tür çalışmalar, yapısal ve fonksiyonel bütünlükleri üreme başarısının belirleyici kriterleri olan bu iki alt katmancının fizyolojik işlevinin deşifre edilmesine yardımcı olacaktır.

Introduction

Bu yöntemin amacı, yumurta sarısını saran ve kuş türlerinin üremesinde temel bir rol oynayan ince bir proteinasöz tabaka olan perivitellin tabakasının (PL) sonraki biyokimyasal karakterizasyonuna izin veren bir protokol sağlamaktır. Literatürde “vitelline membran” olarak da adlandırılan PL, çeşitli glikoprotein türlerinden oluşan üç boyutlu bir kalın lif ağıdır. Yumurtalıkta monte edilen bir iç perivitelline tabakasından (IPL) (yumurta sarısı ile temas halinde) ve IPL(Şekil 1)üzerinde yatan ve infundibulum tarafından üretilen bir dış perivitelline tabakasından (OPL, beyazla temas halinde) oluşur. Bu ikinci doku, yumurtlamadan sonra olgun yumurta sarısı folikül alan yumurta kanalının huni benzeri üst segmenti ve döllenmenin gerçekleştiği bölgedir. OPL salgılanması bu iki olaydan sonra gerçekleşir ve yumurta akı ve yumurta kabuğunun yumurta kanalının diğer belirli segmentlerinde art arda birikmesi ile takip edilir. PL’nin fizyolojik fonksiyonları sadece embriyogenezin döllenmesi ve erken evreleri ile değil, aynı zamanda embriyonun fiziksel ve moleküler korunması ile de ilgilidir. Tüm PL üzerinde gerçekleştirilen tavuk yumurtasının proteomik analizi, 137 farklıproteinin varlığınıortaya koydu 1 , ancak bu proteinlerin çoğunun IPL ve OPL arasındaki dağılımı aydınlatılmaya devam ediyor. Literatür raporunda mevcut olan minimum veri miktarı, IPL ve OPL’nin farklı yapısal ve fonksiyonel özellikler öneren çok farklı protein profilleri2,3,4sergilediğini göstermektedir. Proteinlerin OPL ve IPL arasındaki dağılımına ilişkin verilerin göreceli kıtlığı, ince ve gömülü olan her iki alt katmanları ayırmanın zorluğundan kaynaklanmaktadır.

Burada sunulan yöntem, protein içeriklerini korurken ilgili histolojik yapıları üzerinde sınırlı etkisi olan iki alt katmanları ayırmak ve proteomik tarafından sonraki analizler için proteinlerin tam çözünmesine izin veren protokolü sağlamak için kullanılacak koşulları açıklar. İki ana adım içerir: 1) PL örnekleme ve OPL / IPL ayırma ve 2) PL, OPL ve kütle spektrometre analizi için protein çözünürlüğü ve elektroforezi için IPL tedavisi. İş akışı Şekil 2‘de sunulmuştur. Belirgin bir şekilde, mevcut protokol proteomik analizler için optimize edilmiş olsa da (Adım 2.2), histolojik (örneğin, elektron mikroskopisi), immünohistokimyasal analizler, fonksiyonel çalışmalar (adım 1) ve tuzda çözünen proteinlerin saflaştırılması için yapılarını ve biyolojik aktivitelerini karakterize etmek için bazı adımlarda durdurulabilir (adım 2.1) (Şekil 2).

İlk adım, toplam PL’nin yumurta sarısından çıkarılmasıdır(Şekil 2, adım 1.1). Yayınlanan tüm yöntemler, yumurta akının yumurta sarısından manuel olarak ayrılması veya bir yumurta ayırıcı kullanılması ile başlar. Bunu, kalan yumurta akı ve kalın chalazae’nin emişler kullanılarak veya bir filtre kağıdı üzerinde adsorpsiyon ile çıkarılması takip edilir5 (Şekil 2A). Daha sonra, PL’yi örneklemek için seçilen teknikler yayınlanan makalelere bağlı olarak değişkendir. Bazı kağıtlar, 0,15M NaCl/N-[Tris(hidroksimetil)metil]-2-aminoethanesülonik asit gibi tamponlama çözeltilerinde, 0,85 ila% 1 tuzlu çözelti2,7,8‘de, deiyonize veya damıtılmış suda yumurta sarısının birkaç yıkanmasını içerir. pH 7.44veya 0.01N HCl (pH 2)3. Bu prosedürler tavuk, ördek, halka boyunlu sülün, gri keklik, kakadu papağanı, evcil güvercin veya ratitesyumurtalarınauygulandı 2,6,9. Yumurta sarısı sulu çözeltiler olmadan bir Petri kabında tutulurken PL’nin çıkarılması çok zahmetli olabilir, çünkü PL kırılgandır ve yumurta sarısı PL1,5’e yapışma eğilimindedir ve bu nedenle daha sonra ortadan kaldırılması zor kalır. 37 °C 3’te bir saat boyunca asidik tampon veya çözelti kullanımı da tercih edilir, çünkü bu koşullar PL yapısını değiştirebilir ve protein kaybına neden olabilir. Germinal diski içeren alanın çıkarılması da önemlidir, çünkü bu bölgenin pl 4,6,10 (Şekil 2B)tamamını yansıtmayan ayrı bir yapısal ve moleküler desene sahip olması muhtemeldir. Bu yöntem, yayınlanan bazı makaleler tarafından vurgulanan fikirlerden yararlanır ve bütünlüğünü korurken PL örneklemeyi kolaylaştırmak için bazı iyileştirmeler önerir (Şekil 2C).

İkinci adım iki alt katmandan oluşur (Şekil 2, adım 1.2). OPL ve IPL birbirine sıkıca bağlı olduğu için bu adım kritik öneme sahiptir. Bu adım, dürbün diseksiyon mikroskobu altında torptiklerle dikkatlice yapılmalıdır. OPL/IPL ayrımını bildiren yayınlar oldukça sınırlıdır2,3,7,11 ve bazıları sublayerlerin histolojik yapısını etkilemesi ve/veya protein kaybına veya yumurta sarısı veya beyaz kontaminasyonlarına katkıda bulunma olasılığı olan belirli koşullar (1 h2,3 için37°C’de asidik tampon) kullanır. OPL’yi IPL’den daha iyi ayırt etmek için, bazı yazarlar OPL’yi hafifçe renklendirmek için toluidin mavisinin kullanıldığını bildirdi (iç katman renksiz kalır)11. Geliştirilen yöntemde, ayırmanın kolayca elde edilmesini ve herhangi bir boya kullanılmasını gerektirmeyecek şekilde koşulları optimize ettik (Şekil 2D).

İkinci ana adım, her bir alt katman oluşturan proteinlerin çözünmesidir. Klasik olarak, temiz liyofilize1,kurutulmuş2, 6veya taze hazırlanmış3, 4,11 PL / sublayers doğrudan elektroforezi için kullanılan Laemmli tampon ile karıştırılarak elde edilir. Diğer yazarlar% 1 NaCl’de,% 1 SDS tamponlama çözeltisinde 2,3,11 veya oda sıcaklığında proteaz inhibitörleri ve SDS6 veya Triton içeren bir çözeltide katmanların ön çözünürlüğünü tercih etti ve ardından 45 ° C12‘de inkübasyon , sürekli kuvvetli karıştırma altında. Bazı yazarlar ayrıca PL’nin fosfat tampon salin veya ürede inkübe edildiği ve sonication13’etabi tutulduğu bir protokol tanımlamıştır. Bu tedavilerin hepsini Laemmli tamponunda bir santrifüjleme ve seyreltme izledi ve çözünmeyen madde (santrifüjlemeden sonra elde edilen pelet) analiz edilecek numuneden atıldığı için katmanlardan eksik protein çözünürlüğü dezavantajını paylaşıyor.

Ek olarak, protein çözünürlüğü için belirli yazarlar tarafından denatüre etme koşullarının (üre, deterjan, yüksek sıcaklık vb.) kullanılması, proteinleri geri dönüşümsüz olarak devre dışı bırakmaları, biyolojik faaliyetlerine müdahale etmeleri ve ayrıca 3D yapılarını bozmaları muhtemel olduğu için karakterizasyon için sonraki protein saflaştırma ile uyumlu değildir. Bu özel adım 2 için protokol, PL/OPL/IPL mekanik yapısızlaştırmadan sonra denatüre olmayan koşullarda en bol proteinlerin çözünmesine izin veren ilk alt adımı içerir, gerekirse daha fazla protein çalışmasına engel olmayacaktır (Şekil 2, adım 2.1) ve elektroforezi ve derinlemesine proteomik için proteinlerin tam çözünmesine izin veren ikinci bir alt adım(Şekil 2, adım 2.2). Yayınlanan çeşitli makalelerden alınan önerileri ve deneysel çalışmalarla doğrulanan yeni fikirlerden kaynaklanan ayarlamaları birleştirir.

Protocol

1.PL, IPL ve OPL örneklemeleri PL örneklemesi Yeni döşenmiş sönmemiş yumurtayı manuel olarak kırın ve sarısını beyazdan ayırmak için cam bir kabın üzerine yatan bir yumurta ayırıcı kullanın. Chalazae’yi küçük makasla çıkarın ve şeffaf ve görünür bir yapı olarak görünen yapışık albümenleri çıkarmak için sarısını bir filtre kağıdının üzerine yuvarlayın (Şekil 2A).DİkKAT: PL’yi makasla delmemeye dikkat edin. Chalazaları çıkarmak için makas yerine cımbız kullanılması PL kırılmasına ve daha sonra yumurta sarısı sızıntısına neden olabilir. Filtre kağıdındaki yuvarlanma adımı kritiktir ve kağıt filtresinin PL kırılmasını tetikleyebilecek emici özellikleri nedeniyle çok hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Bu ilk adımın başarısını ve sonraki tüm adımları optimize etmek için, yumurtlama gününden itibaren kısırlaştırılmamış bir yumurta kullanmak da çok önemlidir. Alternatif olarak, soğutulmuş bir ortamda 10 günden az saklanan yumurtalar kullanılabilir, ancak deneyciler PL değişikliklerinin potansiyel risklerini göz önünde bulundurmalıdır. Sarısını daha önce 4 °C’ye kadar soğutulmuş 10 mM Tris-HCl pH 8 içeren bir kristalizeye batırın ve PL alanını künt makas kullanarak 1 cm’lik bir bölge içindeki germinal diskin üzerinden çıkarın (Şekil 2B).NOT: Başlangıçta PL deiyonize suya daldırıldı, ancak bu yaklaşımın pH kontrolünün olmaması ve daha sonra alt katmanları ayırma zorlukları gibi bazı dezavantajları vardır (adım 1.2). Bu nedenle, Tris konsantrasyonu (Şekil 3A) ve pH (Şekil 3B) dahil olmak üzere çeşitli koşullar test edilmiştir. Deiyonize veya demineralize su yerine pH 8’de tampon kullanımı yumurta fizyolojisine uygundur (yumurta akının pH’ı yumurtlama gününde yaklaşık 7,8’dir)14 ve protein kaybını en aza indirir. Buna karşılık, asidik veya çok alkali pH’ın PL yapısızlaştırmayı ve erken protein çözünürlüğünü tetiklediğinden şüphelenilir (Şekil 3B). 10 mM Tris-HCl pH 8’den oluşan tamponun, yumurta fizyolojisine saygı duyduğu ve önemli protein çözünürlüğe neden olmadığı için optimal olduğu bulunmuştur (çalışma tamponundaki protein konsantrasyonu minimum kalır, Şekil 3A,B). PL’i tampondaki küçük makasla yırtın. Yırtılmış PL’nin iki kenarını asala tutun ve PL’yi yumurta sarısı soyun. PL’yi önps ile koruyun ve pl’yi birkaç kez 10 mM Tris-HCl, pH 8 banyolarında sarısı izine rastlanınçaya kadar durulayın. Bu aşamada PL’nin temiz, beyaz ve tamponda yüzdür olduğundan emin olun. Alt katman ayırma için adım 1.2’de veya biyokimyasal analizler için doğrudan 2.1 adımına işlenebilir. OPL ve IPL örneklemesi OPL’yi plastik bir Petri kabına yukarı doğru koyarak ve mümkün olduğunca az kırışıklıkla düz tutarak tüm PL örneğini yayın. Numuneyi 10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl ile örtün. PL hareketlerini sınırlamak için plastik bir Petri kabı (cam değil) kullanın, çünkü PL plastiğe daha iyi yapışır. OPL tarafını bulmak için, IPL’ye değil, OPL’ye bağlı kalan chalazae’nin konumuna bakın. Bu adım, alt katman ayrımını kolaylaştırmak için küçük NaCl konsantrasyonu (50 mM) gerektirir.NOT: Şekil 3C ve literatür11’desunulan grafiğe dayanarak, bu konsantrasyon büyük protein kaybına yol açmamalıdır. Başlangıçta, daha önceaçıklandığıgibi alt katmanları ayırmak için deiyonize su kullanıldı 1,5,6, ancak bu tekniğin çok zahmetli olduğu ve yapısal PL bütünlüğünün değişmesine neden olduğu bulunmuştur. Bu nedenle, tuz iki alt katmanların ayrılmasını kolaylaştırdığı için farklı NaCl konsantrasyonları (Şekil 3C) test edilmiştir. Bununla birlikte, NaCl konsantrasyonu >100 mM kullanımının PL’den protein çözünürlüğünü / salınımını artırması dikkat çekicidir, bu da buradaki amaç değildir (adım 2’deki amaç bu olacaktır) (Şekil 3C). 10 mM Tris-HCl pH 8 tampona 50 mM NaCl eklemek, iki alt katmanların ayrılmasını kolaylaştırır ve protein kaybını en aza indirir. Toplam PL’i küçük makasla yaklaşık 2 cm x 3 cm’lik parçalar halinde kesin. Her PL parçasının iki katmanını dürbün diseksiyon mikroskobu altında ultra hassas uçlu apselerle mekanik olarak ayırın(Şekil 4). Elde eden IPL ve OPL örneklerini bir sonraki kullanıma kadar -80 °C’de mikrotüplerde ayrı ayrı saklayın.NOT: Protokol burada duraklatılabilir. İki katmanın verimliliğinin ve ayrılma tesisinin büyük ölçüde yumurtanın tazeliğine bağlı olduğu belirtilmelidir. Gerçekten de, depolanan yumurtalar, yumurta akı pH’ındaki hızlı artış ve daha sonra PL gevşemesi (ve zayıflaması) nedeniyle yumurta sarısı indeksinin değişmesi nedeniyle sert iç değişiklikler göstermektedir. IPL, OPL ile karşılaştırıldığında daha kırılgandır. Bu nedenle, OPL’nin yüzünü yukarıda yerleştirmek ve OPL’yipslerle çekerek iki alt katmanları ayırmak tercih edilir. Her iki alt katman da değerli bir özenle ele alınmalıdır. 2. Protein çözünürlüğü ve SDS-PAGE analizleri için örnek tedavi Birincil protein çözünürlüğü IPL ve OPL numunelerini ayrı ayrı dondurarak kurutun. Dondurarak kurutma tamamlandıktan sonra, sızıntıya dayanıklı vida kapağına sahip temiz mikrotüplerdeki her numuneden yaklaşık 1 mg kesin. Kalan numuneleri -80 °C’de uzun süreli depolama için sıkıca kapalı tüplerde saklayın.NOT: Sızıntıya dayanıklı vidalı kapaklı mikrotüplerin kullanımı, numunenin yeniden sulanmasını önlemek için hermetik ve sızıntıya dayanıklı kapatma sağlar ve bu da numuneleri güvence altına alacaktır. Her bir liyofilize sublayer’ın 1 mg’ını 400 μL 50 mM Tris pH 7, 500 mM NaCl ile karıştırın. Mikropartiküllerdeki OPL ve OPL yapılarını parçalamak ve protein çözünürlüğü yapmayı kolaylaştırmak için 30 Hz’de 5 dakika boyunca 2 kez bir mikser değirmeni kullanın. OPL ve IPL içeren numunelerin 400 μL’sini iki temiz mikrotüpte toplayın.NOT: Burada kullanılan tampon protein çözünürlüğü artırmak için seçilmiştir (adım 1’in aksine). Bu tampon, pH 7’de (Şekil 3B)protein çözünürlüğünde bir artış gösteren ve 0,5 M NaCl (Şekil 3C)kullananŞekil 3’tesunulan sonuçlara dayanıyordu. Protokol burada duraklatılabilir. Bu aşamada, numuneler ana PL proteinlerinin protein saflaştırılması için kullanılabilir veya adım 2.2’ye işlenebilir. Elektroforezi için protein çözünürlüğü Numunenin her 400 μL’sine 5x SDS-PAGE numune tamponu (100 μL, 0,25 M Tris-HCl, %0,05 bromofenol mavisi, gliserol, %5 SDS, %5 beta-mercaptoethanol, pH 6,8) ekleyin ve 5 dakika boyunca 100 °C’de ısı ekleyin.NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler -80 °C’de saklanabilir. Protokolün bu aşamasında, OPL ve IPL tamamen çözülür. Numune çözünürlüğü verimliliği, 10.000 x g’da5 dakika boyunca numunelerin santrifüjlenmesi ile değerlendirilebilir. Tam çözünürlükleşme, santrifüjlemeden sonra görünür pelet yokluğu ile karakterizedir. Bu nedenle, tam çözünürlükleşmeden sonra, burada 1 mg liyofilize sublayer’in 1 mg proteine karşılık geldiği düşünülmektedir (500 μL numuneslerindeki protein konsantrasyonu 2 mg / mL’dir). Gerçekten de, PL% 80’den fazla protein2,15’ten oluşur. 5x numune tamponu kullanımı numune seyreltmesini sınırlar, ancak 1x veya 2x örnek tampon da kullanılabilir. Bir SDS poliakrilamid jeline (%4- gradyan jel) maksimum 20 μg protein/şerit yükleyin ve dikey elektroforez sistemi kullanarak 120 V’ta elektroforezi gerçekleştirin.NOT: %4- gradyan jel kullanımı zorunlu değildir, ancak OPL ve IPL ‘nin 250 kDa arasında değişen moleküler ağırlıklara sahip proteinler sergilemesi nedeniyle burada tercih edilir. Kuyuların dibinde çözünmeyen proteinlerin veya protein agregalarının varlığı zayıf çözünmeyi ve numune hazırlama sırasında olası bir eksik adımı göstereceğinden, istifleme jelini (genellikle çıkarılır) tutmak da yararlı olabilir. Elektroforezden sonra, 30 dakika boyunca cam plakalardan ve lekelerden Coomassie Brilliant Blue çözeltisi ( H2O, EtOH, asetik asit ve R250 Coomassie Brilliant Blue) ile lekeyi çıkarın. Jel arka plan açık mavi görünene kadar% 50 H2O, % 40 EtOH,% 10 asetik asit çözeltisi içeren bir çözelti ile lekeyi çözün. Son olarak, poliakrilamid jellerin lekelerini ve rehidrasyonunu elde etmek için jeli deiyonize su içeren Petri kaplarına aktarın. Proteinler şeffaf bir arka planın mavi bantları olarak görünmelidir.

Representative Results

OPL ve IPL, protein profillerini SDS-PAGE ile analiz etmek için yeni döşenmiş bir unfertilize yumurtanın PL’sinden ayrıldı. Tüm protokolün deneysel iş akışı Şekil 2’de gösterilmiştir. Şekil 3 farklı Tris konsantrasyonlarında protein salınımı gösterir (Şekil 3A), çeşitli pH (Şekil 3B) ve farklı NaCl konsantrasyonları (Şekil 3C). Ortaya çıkan iki alt katman dürbün diseksiyon mikroskobu ışığı altında gözlenmiştir ve Şekil 4’te gösterilmektedir ve OPL yoğun, bulutlu ve beyazımsı iken IPL yarı saydamdır. Bu özellikler kısmen alt katman ayrımının verimliliği için tanıklık edebilir. Ayrılmadan sonra, OPL ve IPL bağımsız olarak liyofilize edildi ve protein içerikleri mekanik taşlama, anionik deterjan (SDS) ve azaltıcı bir madde (beta-mercaptoethanol) kombinasyonu ve ardından kaynatma sayesinde tamamen çözüldü. Poliakrilamid jelde (SDS-PAGE elektroforez) göçten sonra, OPL ve IPL örnekleri beklendiği gibi farklı elektroforetik profiller (Şekil 5) sergiler. Şekil 1: Yeni döşenmiş bir kısırlaştırılmamış yumurtanın PL’nin yapısı. Kesitte tüm PL’nin şematik gösterimi ve iletim elektron mikroskopisi mikrografisi (kişisel veriler, ©Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique, University and CHRU of Tours, Fransa, S. Georgeault). Bu resmin bu protokolde sunulduğu gibi hazırlanan PL’den elde edildiğini unutmayın. OPL, dış perivitellin tabakası; IPL, iç perivitellin tabakası. Siyah ok ucu, iki alt katmandan ayıran sürekli zarı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Protokolün iki ana adımını ve uygulama örneklerini özetleyen iş akışı. Protokol PL katmanlarının proteomik analizi için optimize edilmiştir, ancak diğer uygulamalar için bazı adımlarda durdurulabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: PL örneklemesi için tampon bileşiminin optimizasyonu. Kısaca, temiz PL (n = 4) 2 saat boyunca çeşitli tamponlama çözeltilerinin aynı hacminde inkübe edildi.PL çıkarıldı ve protein konsantrasyonu kalan tamponda 280 nm’de absorbans ölçülerek tahmin edildi. (A) pH 8’de Tris-HCl konsantrasyonunun etkisi. (B) pH etkisi (7 ila 9). (C) NaCl konsantrasyonunun etkisi. Bu sonuçlardan 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM NaCl’den oluşan tamponun protein kaybını sınırlandırdığım için en uygun olduğu sonucuna vardık. Sonuçlar, dört farklı PL örneğinin ortalama ± standart sapması olarak ifade edilir. İstatistiksel analizler tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey’in çoklu karşılaştırma testi kullanılarak gerçekleştirildi. P değeri <0.05 anlamlı olarak kabul edildi (ns, önemli değil; * p<0.05, *** p<0.001, **** p<0.0001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Dürbün diseksiyon mikroskobu altında OPL ve IPL özellikleri. Ayrılmadan sonra, IPL (sağda) yarı saydam ve OPL (solda) opak görünüyordu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Taze serilmiş söllenmemiş yumurtadan ayrılmış OPL ve IPL’nin SDS-PAGE analizi. %4- akrilamid jel ve ardından Coomassie parlak mavi boyama. Moleküler ağırlık standart bantlarının kütlesi kDa’da belirtilmiştir. OPL profili esas olarak moleküler kütleli proteinlerden oluşur >30 kDa, IPL profilinde tespit edilen ana bantlar moleküler kütlelere sahiptir <30 kDa. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Mevcut protokolün başarısı, bağımsız olarak optimize edilmiş iki kritik adıma dayanır: OPL ve IPL’nin mümkün olduğunca az yapılandırıcı olması gereken mekanik ayrımı, ardından her bir alt katmandaki tam protein çözünürlüğü, yani yapılandırıcı ve denatüre. Ayrıca, her adımın başarılı bir şekilde başarıya ulaştırılmasını sağlamak için dikkate alınması gereken bazı özel noktaları da vurgular.

Protokol yumurta kabuğu rengine, yumurta ağırlığına, üretim türüne veya tavukların genetik türüne bağlı değildir. Bununla birlikte, yumurtanın tazeliğine bağlıdır. Gerçekten de, yumurta döşendikten sonra hızlı bir şekilde derin iç fizikokimyasal değişikliklere uğrar, ancak depolama soğutma koşulları altında gerçekleştirildiğinde bu değişiklikler gecikebilir14,15. Depolama sırasında yumurta kabuğu gözeneklerinden karbondioksit kaybı, yumurta akı pH’ının (7,8’den 9,5’e) artmasına neden olurken, PL genelinde yumurta sarısı ve beyaz arasında bazı su değişimleri meydana gelir. Her iki modifikasyon da PL’nin zayıflayan moleküler ve histolojik yapısını olumsuz yönde etkiler14,15, muhtemelen protein içeriğinin fizikokimyasal modifikasyonları nedeniyle16,17,18. Özellikle depolama oda sıcaklığında uzun bir süre yapılırsa, sublayerlerin ayrılmasının depolanan yumurtalarla çok zorlaşacağı varsayılıyor. Bugüne kadar, protokol 4 °C’de 4 günden daha az bir süre saklanan yumurtalar kullanılarak gerçekleştirildi ve bir yumurtanın PL alt katmanlarını verimli bir şekilde örneklemesi için maksimum depolama süresi henüz bilinmemektedir. Ek olarak, amaç her alt katman analizi ise, kısırlaştırılmamış yumurtaların kullanılması çok önemlidir. Yumurtlama gününde, döllenmiş bir yumurtanın embriyosu 23 saat eskidir ve yumurta inkübe edilirse, gelişimi daha sonra çok hızlıdır. Gerçekten de, embriyonik gelişim ve bazı ekstraembryonic yapıların büyümesi PL’yi bir substrat olarak kullanarak genişler, bu da hızla bozulur ve yerini ekstraembryonic yumurta sarısı kesesi19’aalır.

Yumurta sarısı ve yumurta akının manuel olarak ayrılmasından sonra, yumurta sarısının yumurta akı izlerinden ve PL’ye sıkıca bağlı kalan chalazae’den temizlenmesi gerekir. Uç, yumurta sarısını bir filtre kağıdının üzerine dikkatlice yuvarlamak ve tamponlanmış çözeltilerde (10 mM Tris-HCl pH 8) yumurta sarısının kapsamlı yıkamalarını gerçekleştirmektir. Tampon için kullanılan pH, yumurta akı14’ün fizyolojik pH’ı ile uyumludur ve protein kaybını en aza indirdiği gösterilmiştir (Şekil 3). Daha sonra soğutmalı bir tamponun kullanılması PL’nin yumurta sarısından çıkarılmasına yardımcı olacaktır, çünkü 4 °C’de tampon, lipidik yumurta sarısı geri çekildikçe ve bu sıcaklıkta daha az sıvı hale geldikçe PL çıkarılmasını kolaylaştıracaktır. Ek yıkamalar, yumurta sarısı kalıntılarının PL’den uzaklaştırılmasına izin verecektir. Germinal diske karşılık gelen bölgeyi kesmek de önemlidir, çünkü dişi pronükleus içeren bu yapı PL’yi temsil etmeyebilir. Yumurta döllendiğinde embriyonik hücrelerin döllenme ve çoğalma yeridir. Tüm PL’yi temsil etmeyen belirli bir bileşime sahip olması gerekir, bu da kaldırılmasının nedenidir. Bu özel adım, yumurta sarısı soğuk bir tampona batırıldığında güçlü bir şekilde kolaylaştırılmıştır. Bu germinal disk yapısı mevcut protokolde (hedeflerin dışında) atılmış olsa da, bu alanın döllenmiş yumurtalardaki spesifik analizleri, embriyogenez 19,20,21’inerken aşamalarında PL içeriğinin(proteomik ve aktivite) ve yapının (elektron mikroskopisi) evrimini incelemek isteyen bilim adamları için çok yararlı olabilir. Bu aşamada, tüm PL yapısal olarak sağlamdır ve elektron mikroskopisi (Şekil 2), adım 1.2veya adım 2.1 (amaç tüm PL’yi analiz etmekse) ile daha fazla yapısal analiz için işlenebilir.

PL çok ince ve kırılgan (yaklaşık 10 μm kalınlığında) olduğundan, adım 1.2’nin dürbün diseksiyon mikroskobu altında yapılması gerekir. Sublayerlerin ayrılması suda veya minimum tuzdan yoksun tamponda neredeyse imkansızdır ve bu seçenekleri kullanan ilk girişimler ciddi PL hasarına neden oldu. Bu nedenle, bu adım için seçilen tampon fizyolojik pH’da (pH 8) kalır ve 50 mM NaCl içerir. Bu adım meşakkatlidir ve PL yırtılmasını önlemek için dikkatli ve nazikçe yapılmalıdır. Ayrıldıktan sonra, iki alt katman tuhaf fiziksel özellikler (opak ve yarı saydam) sergiledikleri için kolayca tanımlanabilir. Mikroskop ışığı altında IPL’nin homojenlik eksikliği, tamamlanmamış bir ayrımı ve dolayısıyla IPL’de bulunan kalan OPL noktalarının varlığını yansıtmalıdır. Ek olarak, tüm zarı tedavi etmek çok zordur ve 2 cm x 3 cm’lik parçaların kullanımı başarı şansını büyük ölçüde arttırır. Elde edilen sublayer elektron mikroskopisi ile histolojik çalışma için uygundur (Şekil 1). Sürekli membran (CM) adı verilen belirli bir doğrusal yapının (0,05 ila 1 μm kalınlığında) mikrografi grafikte(Şekil 1)görünür olması ve ayırma işlemi sırasında genellikle bir veya diğer alt katmana bağlı kalması dikkat çekicidir. Daha önce, ayırma için nispeten yüksek bir tuz azı dişi (500 mM) kullanılırken, CM’nin OPL7’ye bağlı kaldığı, su5 kullanımının ise CM’nin IPL’ye bağlanmasını tercih edeceği yayınlanmıştır. Bu protokolde, belirli hedeflere (PL sublayer yapısal olarak bozulmamış ve minimum protein kaybı) ulaşmak için düşük tuz azı dişleri kullanılır, bu da bu CM’nin muhtemelen IPL ile ilişkili olduğu anlamına gelir. Bununla birlikte, IPL ve OPL’nin iletim elektron mikroskopisi ile ek analizi bu hipotezi açıkça belirtir. 1. adımın sonunda elde edilen PL, OPL veya IPL katmanları, sperm-yumurta bağlama analizleri22 için in vitro tahliller veya embriyonik gelişimin erken adımlarını analiz etmek için de kullanılabilir23,24.

Adım 2, protein içeriğinin kısmen (adım 2.1) veya tamamen (adım 2.2) çözünür hale getirilmesi anlamına gelir. PL ve/veya OPL ilk olarak su moleküllerini çıkarmak ve hassas ağırlık ölçümlerine izin vermek için liyofilize edilir. Gerçekten de, PL esas olarak sudan oluşur (%88)7, kuru madde esasen proteinler (çalışmalara bağlı olarak% 80 ila% 90), karbonhidratlar, yağlar ve mineralleriçerir 2,7,25. PL’de bulunan suyun dondurularak kurutularak çıkarıldığı, karbonhidratların esasen PL glikoproteinlerinde geri kazanıldığı ve yumurta sarısından kaynaklanan yağ ve minerallerin esasen kapsamlı yıkamalar tarafından atıldığı göz önüne alındığında, ortaya çıkan PL’nin neredeyse sadece proteinlerden oluştuğu varsayılır. Bu nedenle, tam liyofilizasyondan sonra elde edilen kilo değeri esas olarak proteinlere karşılık gelmelidir. Eşit miktarda PL, OPL ve/veya IPL daha sonra 0,5 M NaCl içeren tamponda seyreltilir. Yüksek tuz azlığı, lifli ağın öğütülerek mekanik tahribatına birleştiğinde, denatüre olmayan koşullarda protein çözünürlüğü büyük ölçüde kolaylaştırır. Bu adımı kaynama, SDS deterjanı ve azaltıcı madde beta-mercaptoethanol (adım 2.2) kullanılarak tam çözünürleştirme izler. Gerçekten de, bazı IPL proteinleri SDS çözünür glikoproteinlerdir25,26,27 ve OPL’nin ana bileşenleri NaCl-çözünür1,11 ‘dir. Bu protokolü kullanarak, santrifüjlemeden sonra çözünmeyen proteinlerin kalan peletini görmedik, bu da çözünürlüğün muhtemelen tamamlandığını gösteriyor. Pl, OPL ve/veya IPL proteinleri daha sonra SDS-PAGE tarafından analiz edildi. Elde edilen protein profilleri yayınlanan literatür2,4,11,16ile tutarlıdır, ancak sinyalin çözünürlüğü ve yoğunluğu çeşitli IPL ve OPL bağımsız örneklemeleri arasında oldukça geliştirilmiş ve çok daha homojendir.

Ek olarak, OPL ve IPL arasındaki nicel karşılaştırma, ilgili alt katmanlar için çıkardığımız ağırlığın doğruluğu sayesinde mümkündür2,7. Ayrıca, hem OPL hem de IPL profilleri çok farklıdır ve 14 kDa ve 75 kDa’daki soluk bir bant dışında, her iki PL alt katman da aynı moleküler ağırlığı gösteren bantları gözle görülür şekilde paylaşmaz. Bu gözlem, önemli bir çapraz kontaminasyon olmadan alt katmanların ayrılmasının verimliliğini doğrular. Yayınlanan tek PL proteomik analize göre1, OPL ‘deki en yoğun bantlar (30 kDa) büyük olasılıkla Zona-Pellucida protein 1 (102 kDa) ve Zona-Pellucida protein 3 ‘tür (47 kDa). Çok bol PL proteinleri ovotransferrin (78 kDa), ovalbumin ile ilişkili protein X (45 kDa), ovalbumin (43 kDa)1’in sublayers arasındaki dağılımı aydınlatılmaya devam eder. Gerçekten de, bu proteinlerin yüksek moleküler ağırlığı (>30 kDa), SDS-PAGE profiline dayanan IPL proteinleri olduklarını göstermektedir, ancak doku özgüllükleri (oviduct eksprese proteinleri) bu proteinleri OPL28,29ileilişkilendirmeyi tercih eder. Ayrıca, bazıları pl örneklerinin yetersiz yıkamalar nedeniyle yumurta akı ve yumurta sarısı proteinleri tarafından potansiyel olarak kirlenmesini önermektedir1. Bu eksik bilgi, PL, OPL ve IPL’nin derinlemesine nicel proteomikleri için daha fazla kullanılacak olan mevcut protokolün geliştirilmesinin temelidir.

Alternatif olarak, çözünmeyen maddeyi çıkarmak için adım 2.1’den ve santrifüjlemeden sonra, daha fazla biyokimyasal ve biyolojik karakterizasyon için bazı spesifik proteinler çıkarmak mümkündür. Böyle bir yaklaşım son zamanlarda OPL’nin iki ana bileşeni olan vitelline membran dış tabaka proteini 1 (VMO1) ve kuş beta-defensin 11 (AvBD11)30,31’in biyolojik faaliyetlerini ve/ veya3Dyapısını karakterize etmek için uygulanmıştır. Bu proteinlerin saflaştırılmış moleküller olarak mevcudiyeti, immünhistokimya gibi ek deneyler veya Enzim Bağlantılı İmmünorbent Tahliller de dahil olmak üzere nicel tahlillerin geliştirilmesi için spesifik antikorlar üretmeye yardımcı olabilir.

Bu protokolün iki önemli sınırlaması (1) özellikle yumurtalar 4 °C’de 4 günden fazla depolanmışsa ve (2) tam protein çözünürlüğü, elde edilen numunelerin iç biyolojik aktivitesini bozan tamponların azaltılmasını ve denatüre edilmesini gerektiriyorsa, alt katmanların ayrılmasıyla ilgili zorluktur. İlk sınırlama ile ilgili olarak, mekanik ayırma teknik beceriler gerektirir, ancak 2 veya 3 deneysel eğitimden sonra kolayca elde edilir. Bazı IPL küçük parçaları OPL’ye bağlı kalabilir ve bunun tersi de her iki alt katman da sıkı bir şekilde ilişkilidir. Bununla birlikte, mekanik ayırma dikkatli bir şekilde yapılırsa, bir alt katman diğerinin kirlenmesi minimum olmalıdır. En uygun alt katman ayrımından sonra tipik IPL ve OPL SDS-PAGE profilleri Şekil 5’tegösterilmiştir. İkinci sınırlama ile ilgili olarak, bu makalede sunulan deneysel adımlar, her alt katman oluşturan proteinlerin kapsamlı bir listesini sağlamak için proteomik analizler için optimize edilmiştir. Her proteinin biyolojik faaliyetlerinin daha fazla karakterizasyonu için, denatüre etme koşullarını kullanmadan önce adım 2.1.2’de durmak gerekir (adım 2.2.1, SDS ile tampon kullanımı ve beta-mercaptoethanol ve ardından kaynatma). Bununla birlikte, 2.1.2 adımından kaynaklanan proteinlerin sadece tuzda çözünür proteinler iken tuz çözünmeyen proteinlerin agregalar oluşturması dikkat çekicidir. İlgili aktivitelerini daha fazla değerlendirmek için bir seçenek, heterolog sistemler(E. coli, baculovirus, maya, vb.) kullanarak rekombinant proteinler olarak tuz çözünmeyen proteinler üretmek olabilir.

Bu protokol, her türün orijinalliğini daha iyi takdir etmek için karşılaştırmalı çalışmalar için diğer kuş yumurtalarına uyarlanabilir. Gerçekten de PL, hem yapısal olarak hem de protein bileşimi açısından, muhtemelen yeni ortamlara adaptasyon nedeniyle, aynı zamanda gelişimsel özgüllükler 2 , 6,9,32için bazı kuş özgüllükleri görüntüler. Orta derecede teknik ve klasik ekipman/malzeme gerektiren bu protokolün geliştirilmesi, kuş üremesi ve spesifikasyon çalışmaları alanında yeni araştırma yolları açmaktadır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Philippe Didier ve Karine Anger’e (INRAE, PEAT, 37380, Nouzilly, Fransa, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) döllenmemiş Isa-brown yumurtaları sağladıkları için minnettarız. M. Bregeon’un doktorasının finansmanı için Fransa Tours Üniversitesi’ne de teşekkür ediyoruz. Bu çalışma Fransa Ulusal Araştırma Ajansı’ndan (EQLIPSE, ANR-19-CE21-0006) finansal destek aldı.

Materials

Binocular dissecting microscope Vision Engineering, France Model Mantis Elite
Lyophilizer Cryotec, France Model Cosmos 80
Mini-Protean II electrophoresis cell Biorad, Hercules, USA 1652960 Any apparatus adapted for protein electrophoresis
Mixer Mill MM400 Retsch, Hann, Germany 20.745.0001 Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample
Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm Dutscher, Brumath 5066
Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm Dutscher, Brumath 327005
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mann, K. Proteomic analysis of the chicken egg vitelline membrane. Proteomics. 8 (11), 2322-2332 (2008).
  2. Chung, W. H., Lai, K. M., Hsu, K. -. C. Comparative study on histological structures of the vitelline membrane of hen and duck egg observed by cryo-scanning electron microscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (3), 1794-1799 (2010).
  3. Kido, S., Doi, Y. Separation and Properties of the Inner and Outer Layers of the Vitelline Membrane of Hen’s Eggs. Poultry Science. 67 (3), 476-486 (1988).
  4. Steele, M. G., Meldrum, W., Brillard, J. P., Wishart, G. J. The interaction of avian spermatozoa with the perivitelline layer in-vitro and in-vivo. Journal of Reproduction and Fertility. 101 (3), 599-603 (1994).
  5. Bain, J. M., Hall, J. M. Observations on the development and structure of the vitelline membrane of the hen’s egg: an electron microscope study. Australian Journal of Biological Sciences. 22 (3), 653-665 (1969).
  6. Damaziak, K., Kieliszek, M., Buclaw, M. Characterization of structure and protein of vitelline membranes of precocial (ring-necked pheasant, gray partridge) and superaltricial (cockatiel parrot, domestic pigeon) birds. PLoS One. 15 (1), 0228310 (2020).
  7. Bellairs, R., Harkness, M., Harkness, R. D. The vitelline membrane of the hen’s egg: a chemical and electron microscopical study. Journal of Ultrastructure Research. 8 (3-4), 339-359 (1963).
  8. Kido, S., et al. Characterization of vitelline membrane outer layer protein I, VMO-I: amino acid sequence and structural stability. Journal of Biochemistry. 117 (6), 1183-1191 (1995).
  9. Damaziak, K., et al. Comparative analysis of structure and strength of vitelline membrane and physical parameters of yolk of ostrich, emu, and greater rhea eggs. Poultry Science. 97 (3), 1032-1040 (2018).
  10. Kirunda, D. F., McKee, S. R. Relating quality characteristics of aged eggs and fresh eggs to vitelline membrane strength as determined by a texture analyzer. Poultry Science. 79 (8), 1189-1193 (2000).
  11. Back, J. F., Bain, J. M., Vadehra, D. V., Burley, R. W. Proteins of the outer layer of the vitelline membrane of hen’s eggs. Biochimica Et Biophysica Acta. 705 (1), 12-19 (1982).
  12. Waclawek, M., Foisner, R., Nimpf, J., Schneider, W. J. The chicken homologue of zona pellucida protein-3 is synthesized by granulosa cells. Biology of Reproduction. 59 (5), 1230-1239 (1998).
  13. Okumura, H., et al. A newly identified zona pellucida glycoprotein, ZPD, and dimeric ZP1 of chicken egg envelope are involved in sperm activation on sperm-egg interaction. Biochemical Journal. 384, 191-199 (2004).
  14. Guyot, N., Rehault-Godbert, S., Nys, Y., Baron, F., Roberts, J. Understanding the natural antibacterial defences of egg white and their regulation. Achieving Sustainable Production of Eggs Volume 1. 1, 161-193 (2016).
  15. Trziszka, T., Smolinska, T. Chemical Characterization of the Vitelline Membrane of Hens Eggs. Food Chemistry. 8 (1), 61-70 (1982).
  16. Berardinelli, A., Ragni, L., Giunchi, A., Gradari, P., Guarnieri, A. Physical-mechanical modifications of eggs for food-processing during storage. Poultry Science. 87 (10), 2117-2125 (2008).
  17. Kelley, A. J. The effects of storage time on vitelline membrane protein banding patterns and interior egg quality of eggs from nonmolted and molted hens. Texas A&M University. , (2003).
  18. Schafer, A., Drewes, W., Schwagele, F. Analysis of vitelline membrane proteins of fresh and stored eggs via HPLC. Zeitschrift Für LebensmittelUntersuchung Und-Forschung A. Food Research and Technology. 206 (5), 329-332 (1998).
  19. Romanoff, A. L. . The avian embryo: Structural and functional development. , (1960).
  20. Haas, H. J., Spratt, N. T. Contributions to an analysis of the avian vitelline membrane’s potential to promote outgrowth of the yolk sac-serosal membrane. The Anatomical Record. 184 (2), 227-231 (1976).
  21. Jensen, C. Ultrastructural changes in the avian vitelline membrane during embryonic development. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 21 (3), 467-484 (1969).
  22. Barbato, G. F., Cramer, P. G., Hammerstedt, R. H. A practical in vitro sperm-egg binding assay that detects subfertile males. Biology of Reproduction. 58 (3), 686-699 (1998).
  23. New, D. A. T. The Adhesive Properties and Expansion of the Chick Blastoderm. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 7 (2), 146-164 (1959).
  24. New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3 (4), 326-331 (1955).
  25. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen’s egg. I. Membrane structure and its deterioration with age. Journal of Biochemistry. 78 (2), 261-268 (1975).
  26. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen’s egg. II. Physicochemical properties of glycoprotein I. Journal of Biochemistry. 79 (6), 1351-1356 (1976).
  27. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen’s egg. III. Physicochemical properties of glycoprotein II. Journal of Biochemistry. 81 (5), 1543-1548 (1977).
  28. Réhault-Godbert, S., et al. Ovalbumin-related protein X is a heparin-binding ov-serpin exhibiting antimicrobial activities. Journal of Biological Chemistry. 288 (24), 17285-17295 (2013).
  29. Gautron, J., et al. Ovotransferrin is a matrix protein of the hen eggshell membranes and basal calcified layer. Connective Tissue Research. 42 (4), 255-267 (2001).
  30. Guyot, N., et al. Proteomic analysis of egg white heparin-binding proteins: towards the identification of natural antibacterial molecules. Scientific Reports. 6, 27974 (2016).
  31. Guyot, N., et al. function, and evolution of Gga-AvBD11, the archetype of the structural avian-double-beta-defensin family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 337-345 (2020).
  32. Mori, M., Masuda, N. Proteins of the vitelline membrane of quail (Coturnix coturnix japonica) eggs. Poultry Science. 72 (8), 1566-1572 (1993).

Tags

Perivitelline MembranePerivitelline LayerOuter Perivitelline LayerInner Perivitelline LayerHen’s EggsEgg YolkEgg WhiteChalazaeProtein SolubilizationProteomicsMechanical SeparationTris-HCl BufferSodium ChlorideFreeze-dryingProtein Extraction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bregeon, M., Guyot, N., Réhault-Godbert, S. Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen’s Eggs. J. Vis. Exp. (167), e61739, doi:10.3791/61739 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image