鶏卵からの外側および内側のペリビテリンサブ層の機械的分離とタンパク質可溶化

本プロトコルの成功は、独立して最適化された2つの重要なステップに依存しています:OPLとIPLの機械的分離は、可能な限り脱構造化する必要があり、その後、各サブ層の完全なタンパク質可溶化が続き、逆に脱構造化と変性が行われます。また、各ステップの成功を確実にするために考慮する必要があるいくつかの特定の点も強調しています。

プロトコルは、卵殻の色、卵の重量、生産の種類、または鶏の遺伝的株に依存しません。しかし、卵の鮮度によって異なります。実際、卵は産卵後すぐに深い内部物理化学的修飾を受けるが、冷蔵条件下で保存を行うとこれらの変化は遅れる可能性がある^14,15。貯蔵中に卵殻の毛穴を通して二酸化炭素が失われると、卵白pH(7.8から9.5)が増加し、PL全体で黄身と白の間でいくつかの水の交換が行われます。いずれの改変も、そのタンパク質含有量^16、17、18の物理化学的修飾に起因する可能性が低い^14、15と弱まるPLの分子および組織構造に悪影響を及ぼす。特に保存された卵の貯蔵が室温で長期間行われる場合、サブ層の分離は非常に困難なものと考えられます。最新の状態では、プロトコルは4°Cで4日未満保存された卵を用いて行われ、PLサブレイヤーを効率的にサンプリングするための卵の貯蔵期間の最大持続時間はまだ分かっていない。また、各サブ層の解析が目的である場合、未受精卵を使用することが重要です。産卵の日には、受精卵の胚は23時間古く、卵子がインキュベートされた場合、その後、その発達は非常に迅速である。実際、胚発生およびいくつかの胚外構造の成長は、PLを皮下として使用して拡大し、このように急速に分解され、胚外黄身嚢¹⁹に置き換えられる。

卵黄と卵白を手動で分離した後、卵白の痕跡とPLにしっかりと付着したままのチャラザから黄身を洗浄する必要があります。チップは、フィルター紙の上に慎重に黄身を転がし、緩衝溶液(10 mM Tris-HCl pH 8)で黄身の広範な打ち解きを行うことである。バッファーに使用されるpHは、卵白¹⁴の生理学的pHと一致しており、タンパク質の損失を最小限に抑えることが示されている(図3)。4°Cでは、リピシック黄身が後退し、この温度で液体が少なくなるので、冷蔵緩衝液を使用すると、卵黄からPLを除去するのに役立ちます。追加の打ち込みにより、PLから黄身残渣を除去することができます。また、雌の前核を含むこの構造はPLの代表ではない可能性があるため、胚盤に対応するゾーンを切り取ることも重要である。卵子が受精したときの胚細胞の受精と増殖の部位である。PL全体を代表しない特定の組成物を有することになっているが、これが除去された理由である。この特定のステップは、黄身がコールドバッファーに浸漬される際に強く促進される。この胚ディスク構造は、現在のプロトコル(目的外)では廃棄されるが、受精卵中のこの領域の特定の分析は、胚発生^19、20、21の初期段階において、PL内容(プロテオミクスおよび活性)および構造(電子顕微鏡)の進化を研究する科学者にとって非常に有用であり得る。この段階では、PL全体が構造的に無傷であり、電子顕微鏡法(図2)によって更なる構造解析のために処理され、ステップ1.2またはステップ2.1(目的はPL全体を分析すること)に至る。

PLは非常に薄く、壊れやすい(厚さ約10μm)であるため、ステップ1.2は双眼解剖顕微鏡の下で行う必要があります。サブレイヤーの分離は、水や最小限の塩を欠く緩衝液ではほとんど不可能であり、これらのオプションを使用した最初の試みは深刻なPL損傷をもたらしました。したがって、この工程のために選択された緩衝液は生理学的pH(pH8)に留まり、50 mM NaClを含有する。このステップは困難であり、PLの引き裂きを防ぐために慎重かつ穏やかに行わなければなりません。分離されると、2つのサブレイヤーは、特異な物理的特徴(不透明と半透明)を示すため容易に識別できます。顕微鏡の光の下でのIPLの均質性の欠如は不完全な分離を反映し、したがってIPLに存在するOPLの残りのスポットの存在を反映すべきである。さらに、膜全体を治療することは非常に困難であり、2cm x 3 cmの部分の使用は大きく成功の可能性を高める。得られたサブ層は電子顕微鏡による組織学的研究に適している(図1)。連続膜(CM)という特定の線形構造(0.05~1 μm厚)が顕微鏡写真(図1)に見え、分離の過程で通常一方または他方のサブレイヤに付着したままであることに注目してください。分離のために比較的高い塩分モルリティ(500mM)を使用する場合、CMはOPL⁷に取り付けられたままであり、水⁵の使用はIPLへのCMの取り付けを好むと以前に公表されている。このプロトコルでは、低塩モルリティが特定の目的(PLサブレイヤーは構造的に無傷で、タンパク質の損失を最小限に抑える)を達成するために使用され、これは、このCMがIPLに関連している可能性が高いことを意味します。しかし、透過電子顕微鏡によるIPLとOPLの追加分析は、この仮説に明確に述べられるであろう。ステップ1の終わりに得られたPL、OPL、またはIPL層は、精子・卵子結合解析²²のためのインビトロアッセイに用いてもよいし、胚発生^23、24の初期段階を分析するためにも用いることができる。

ステップ2は、タンパク質含量の可溶化をいい、部分的に(ステップ2.1)または完全に(ステップ2.2)。PLおよび/またはOPLは水分子を除去し、精密な重量測定を可能にするために最初に凍結乾燥される。実際、PLは主に水(88%)7で構成され、乾燥物質は本質的にタンパク質(研究に応じて80%〜90%)、炭水化物、脂肪、およびミネラル^2、7、25を含む。PLに含まれる水が凍結乾燥によって除去され、糖質が基本的にPL糖タンパク質で回収され、卵黄から生じる脂肪やミネラルが本質的に広範な清水によって廃棄されることを考慮すると、得られたPLはタンパク質からほぼ独占的に構成されていると仮定されます。したがって、完全凍結乾燥後に得られる重量値は、主にタンパク質に対応すべきである。PL、OPL、および/または IPL の量は、0.5 M NaCl を含むバッファー内で希釈されます。高塩モルリティを粉砕することにより繊維網の機械的破壊に組み合わせることで、非変性条件下でのタンパク質可溶化を大いに促進する。このステップは、沸騰を用いた完全な可溶化、SDS洗剤および還元剤β-メルカプトエタノール(ステップ2.2)に続く。実際、いくつかのIPLタンパク質は、SDS溶性糖タンパク質^{25、26、27であり、OPL}の主要な構成要素はNaCl溶性^1、11である。このプロトコルを使用すると、遠心分離後に不溶性タンパク質の残りのペレットは見られず、可溶化が完了した可能性が高いことを示しています。PL、OPL、および/またはIPLからのタンパク質をSDS-PAGEによって分析した。結果として得られるタンパク質プロファイルは、公開された文献^{2、4、11、16}と一致するが^、シグナルの分解能と強度は高度に改善され、様々なIPLとOPL独立サンプリングの間ではるかに均質である。

また、OPLとIPLの定量的比較は、それぞれのサブレイヤ^2,7について推測した重量の精度のおかげで可能になります。さらに、OPLとIPLの両方のプロファイルは非常に明確であり、14 kDaおよび75 kDaのかすかなバンドを除いて、両方のPLサブレイヤーが同じ分子量を示すバンドを目に見えて共有しません。この観察は、重大な交差汚染のないサブ層分離の効率を裏付ける。^1のPLプロテオミクス分析で発表された唯一のPLプロテオミクス分析によると、OPL(30 kDa)の強烈なバンドは、おそらくゾナ・ペルクダタンパク質1(102 kDa)およびゾナ・ペルクダタンパク質3(47 kDa)である。非常に豊富なPLタンパク質のオボトランスフェリン(78kDa)、オボアルブミン関連タンパクX(45kDa)、オボアルブミン(43kDa)1のサブ層間の分布は解明されたままである。実際、これらのタンパク質の高分子量(>30 kDa)は、それらがSDS-PAGEプロファイルに基づくIPLタンパク質であることを示唆しているが、それらの組織特異性(卵性発現タンパク質)はむしろこれらのタンパク質をOPL^28,29に関連付ける。さらに、一部の人々は、不十分な洗浄による卵白および卵黄タンパク質によるPLサンプルの潜在的な汚染を示唆している^1.この情報不足は、本プロトコルの開発の基礎であり、PL、OPL、およびIPLの詳細な定量プロテオミクスに対してさらに使用される。

あるいは、ステップ2.1および遠心分離後から不溶性物質を除去し、さらに生化学的および生物学的特徴付けのためにいくつかの特異的なタンパク質を抽出することができる。このようなアプローチは、OPLの2つの主要成分の生物学的活性および/または3D構造を特徴付けるために最近適用されている、ビテリン膜外層タンパク質1(VMO1)および鳥類β-ディフェンシン11(AvBD11)30、31。これらのタンパク質を精製分子として利用できることは、免疫組織化学などの追加実験や、酵素結合免疫吸着アッセイを含む定量アッセイの開発のための特定の抗体の産生にも役立つ可能性がある。

このプロトコルの2つの大きな制限は、(1)卵が4°Cで4日以上保存されている場合は特にサブレイヤ分離の課題であり、(2)完全なタンパク質可溶化は、得られたサンプルの本質的な生物学的活性を損なう緩衝液の減少と変性を必要とする事実である。最初の制限では、機械的分離は技術的なスキルを必要としますが、2つまたは3つの実験的な訓練の後に簡単に達成されます。IPL の小片の中には、OPL にアタッチされたままの部分と、両方のサブレイヤが密接に関連付けられているものがあります。しかし、機械的分離が慎重に行われる場合、一方のサブレイヤの汚染は、もう一方の部分層による汚染を最小限に抑える必要があります。最適なサブレイヤー分離後の典型的な IPL および OPL SDS-PAGE プロファイルを 図 5に示します。2番目の制限に関しては、この記事で提示された実験的なステップは、各サブレイヤを構成するタンパク質の包括的なリストを提供するために、プロテオミクス分析のために最適化されています。各タンパク質の生物学的活性のさらなる特徴付けのためには、変性条件を使用する前にステップ2.1.2で停止する必要があります(ステップ2.2.1、SDSおよびβ-メルカプトエタノールを用いたバッファーの使用後に沸騰)。しかし、ステップ2.1.2から生じるタンパク質は塩溶性タンパク質のみであり、塩不溶性タンパク質は凝集体を形成する。それぞれの活性をさらに評価する選択肢の1つは、異種系(大腸菌、バキュロウイルス、酵母など)を用いて組換えタンパク質として塩不溶性タンパク質を産生することである。

このプロトコルは、各種の独創性をよりよく理解するために、比較研究のために他の鳥卵に適応することができる。実際、PLは、構造的にもタンパク質組成の観点からも、新しい環境への適応だけでなく、発達特異性^{2、6、9、32}にも起因するいくつかの鳥特異性を表示する。適度な技術性と古典的な機器/材料を必要とするこのプロトコルの開発は、鳥の再生と種分化研究の分野で新しい研究の道を開きます。