JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Механическое разделение и белок Solubilization внешних и внутренних Perivitelline sublayers из куриных яиц

Published: January 27, 2021
doi:
10.3791/61739
, ,
1Institut National de Recherche pour l’Agriculture, l’Alimentation et l’Environnement,Université de Tours, Biologie des Oiseaux et Aviculture, 37380, Nouzilly, France

Summary

В этой статье сообщается простой метод, чтобы изолировать внешние и внутренние perivitelline подслойки куриных яиц при минимизации структурных изменений и оптимизации белка solubilization каждого подслойщика для протеомного анализа.

Abstract

Перивильный слой, окружающий яичный желток, играет основополагающую роль в оплодотворении, в защите яйцеклеток и в развитии птичьего эмбриона. Он формируется двумя белковых субслой, которые тесно связаны и образуются различными женскими репродуктивными органами. Предполагается, что обе структуры имеют свои собственные функциональные особенности, которые еще не определены. Чтобы охарактеризовать функцию белков, составляя каждый подслой, первая задача состоит в том, чтобы установить условия, которые позволили бы для механического разделения этих двух сложных слоев, при ограничении любых структурных повреждений. Второй шаг заключается в оптимизации экспериментальных условий для облегчения белка solubilization от этих двух субслой, для последующего биохимического анализа. Эффективность этого подхода оценивается путем анализа белкового профиля каждого подслойщика по натрию Додекил Сульфат-Поли-Акриламид Гель Электрофорез (SDS-PAGE), который, как ожидается, будет различаться между двумя структурами. Эта двухшаговая процедура остается простой; для этого требуется классическое биохимическое оборудование и реагенты; и совместим с дальнейшей углубленной протеомией. Он также может быть перенесен на другие птичьи яйца для сравнительной биологии, зная, что структура и состав слоя перивильлина, как было показано, имеют видоспецифические особенности. Кроме того, условия, не денатурированные условия, разработанные для разделения субслой (шаг 1), позволяют их структурный анализ путем сканирования и передачи электронной микроскопии. Он также может представлять собой первый шаг для последующей очистки белка для анализа их соответствующей биологической деятельности и 3D-структуры, или для проведения дальнейших иммуногистохимических или функциональных анализов. Такие исследования помогли бы расшифровать физиологическую функцию этих двух субслой, структурные и функциональные целостности которых являются определяющими критериями репродуктивного успеха.

Introduction

Целью данного метода является предоставление протокола, который позволяет последующую биохимическую характеристику слоя перивителлина (PL), тонкого белкового слоя, прилагающего яичный желток и играющего основополагающую роль в воспроизводстве птичьего вида. PL, также названный «вителлиновой мембраной» в литературе, является трехмерной сетью толстых волокон, состоит из нескольких типов гликопротеинов. Он состоит из внутреннего слоя перивиллина (IPL) (в контакте с желтком), который собирается в яичнике, и внешнего слоя перивителлина (OPL, в контакте с белым), лежащего на IPL(рисунок 1) и производится infundibulum. Эта последняя ткань является воронкой, как верхний сегмент яйцеклетки получения зрелых желток фолликула после овуляции, и место, где происходит оплодотворение. Секреция OPL происходит после этих двух событий и сопровождается последовательным отложением яичного белка и яичной скорлупы в других конкретных сегментах яйцеклетки. Физиологические функции PL связаны не только с оплодотворением и ранними стадиями эмбриогенеза, но и с физической и молекулярной защитой эмбриона. Протеомный анализ куриного яйца, выполненный в целом PL показал наличие 137различных белков 1, но распределение большинства из этих белков между IPL и OPL еще предстоит выяснить. Минимальное количество данных, доступных в литературе сообщают, что IPL и OPL демонстрируюточень различные профили белка 2,3,4, что свидетельствует о различных структурных и функциональных свойств. Относительная нехватка данных о распределении белков между OPL и IPL, вероятно, объясняется сложностью разделения обоих субслой, которые являются тонкими и встроенными.

Представленный здесь метод описывает условия, которые будут использоваться для разобщения двух субслой с ограниченным воздействием на их гистологическую структуру при сохранении их содержания белка, а также для обеспечения протокола, разрешающий полную solubilization белков для последующего анализа протеомией. Она включает в себя два основных шага: 1) PL выборки и OPL / IPL разделения и 2) PL, OPL, и IPL лечения белка solubilization и электрофорез для анализа масс-спектрометрии. Рабочий процесс представлен на рисунке 2. Примечательно, что, хотя настоящий протокол был оптимизирован для протеомных анализов (шаг 2.2), его можно остановить на некоторых этапах для гистологического (например, электронной микроскопии), иммуногистохимического анализа, функциональных исследований (шаг 1), а также для очистки солерастворимых белков с целью характеристики их структуры и биологической активности (шаг 2.1) (рисунок 2).

Первым шагом является удаление общего PL из яичного желтка(рисунок 2, шаг 1.1). Все опубликованные методы начинаются с отделения яичного белка от желтка вручную или с помощью яичного сепаратора. За ним следует удаление оставшегося яичного белка и толстых chalazae с помощью типсов или adorption на фильтровальнойбумаге 5 (Рисунок 2A). Далее методы, выбранные для выборки PL, являются переменными в зависимости от опубликованных статей. Некоторые документы включают в себя несколько моет желтка, в деионизированнойили дистиллированной воды 1,5,6, в 0,85 до 1%солевой раствор 2,7,8, в буферизации решений, таких как 0,15 M NaCl/ N-Tris (гидроксиметил)метил-2-аминоэтанесульфоновой кислоты, рН 7,44, или в 0,01N HCl (рН 2)3. Эти процедуры были применены к курице, утке, кольчатому фазану, серой куропатке, какатий попугаю, домашнему голубю илияйцам крысиных клещей 2,6,9. Удаление PL в то время как яичный желток поддерживается в чашке Петри без aqueous решения могут быть очень трудоемкими, как PL является хрупким и яичный желток, как правило, придерживаться PL1,5 и,следовательно, остается трудно устранить потом. Использование кислого буфера или раствора в течение часа при 37 градусовпо Цельсию 3 также не является предпочтительным, поскольку такие условия могут изменить структуру PL и могут привести к потере белка. Важно также удалить область, содержащую зародышевойдиск,как эта зона, вероятно, имеют различные структурные и молекулярные модели, которая не отражает весь PL4,6,10 (Рисунок 2B). Этот метод использует идеи, выделенные в некоторых опубликованных статьях, и предлагает некоторые улучшения для облегчения отбора проб PL, сохраняя при этом егоцелостность (рисунок 2C).

Второй шаг состоит из разделения двух подслоев(рисунок 2, шаг 1.2). Этот шаг имеет решающее значение, поскольку OPL и IPL тесно связаны друг с другом. Этот шаг следует тщательно проводить с помощью типсов под бинокулярным рассечением микроскопа. Публикации отчетности OPL / IPL разделениядовольно ограничены 2,3,7,11 инекоторые из них используют конкретные условия (кислотный буфер при 37 градусов по Цельсию для 1 ч2,3), которые могут повлиять на гистологическую структуру субслой и / или способствовать потере белка или желтка или белого загрязнения. Чтобы лучше отличить OPL от IPL, некоторые авторы сообщили об использовании толуйдина синий слегка цвет OPL (внутренний слой остается бесцветным)11. В разработанном методе мы оптимизировали условия так, чтобы разделение было легко достигнуто и не требует использования какого-либо красителя(рисунок 2D).

Вторым основным шагом является solubilization белков, составляя каждый подслой. Классически, это достигается путем смешивания чистых лиофилизированных1,сушеные 2,6, или свежеприготовленные3,4,11 PL / сублейеров непосредственно с буфером Laemmli используется для электрофореза. Другие авторы предпочли предварительную solubilization слоев в 1% NaCl, в 1% SDS буферизациирешение 2,3,11 или врастворе,содержащем ингибиторыпротеазы и SDS 6 при комнатной температуре или Тритон следуют инкубации при 45 C12, при постоянном энергичном перемешивании. Некоторые авторы также описали протокол, где PL был инкубирован в фосфатный буфер солевой раствор или мочевина и подвергается sonication13. Все эти методы лечения сопровождались центрифугой и разбавлением в буфере Laemmli, и все они имеют недостаток неполной растворимой растворимости белка из слоев, поскольку нерастворимое вещество (гранулы, полученные после центрифугации) выбрасывается из образца для анализа.

Кроме того, использование денатурации условий (мочевина, моющее средство, высокая температура и т.д.) некоторыми авторами для растворимости белка не совместимо с последующей очисткой белка для характеристики, поскольку они могут необратимо инактивировать белки, вмешиваться в их биологическую деятельность, а также ухудшать их 3D-структуру. Для этого конкретного шага 2, Протокол включает в себя первый подшаг, позволяющий solubilization наиболее распространенных белков в условиях, не денатурации после PL / OPL / IPL механической де-структурации, которая не будет вмешиваться в дальнейшие исследованиябелка, еслиэто необходимо ( Рисунок 2 , шаг 2.1), и второй шаг, который позволяет для полной solubilization белков для электрофореза и углубленных протеомов(рисунок 2. Он сочетает в себе предложения, взятые из различных опубликованных работ и корректировок в результате новых идей, подтвержденных экспериментальными исследованиями.

Protocol

1.PL, IPL и OPL выборки Выборка PL Разбейте свежеотложенное неутяжнутое яйцо вручную и используйте яичный сепаратор, лежащий на стакане, чтобы отделить желток от белого. Удалите chalazae с небольшими ножницами и свернуть желток на фильтровальную бумагу, чтобы удалить приверженец альбуна, который появляется как прозрачная и видимаяструктура (рисунок 2A).ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не проколоть PL ножницами. Использование пинцета вместо ножниц для удаления chalazas может спровоцировать PL поломки и последующей утечки желтка. Подвижной шаг на фильтровальной бумаге имеет решающее значение и должен выполняться очень быстро из-за абсорбентных свойств бумажного фильтра, который может вызвать pl поломку. Также очень важно использовать неутвереное яйцо со дня выкладки, чтобы оптимизировать успех этого первого шага и всех последующих шагов. Кроме того, яйца, которые хранились менее 10 дней в охлажденой среде могут быть использованы, но экспериментаторы должны учитывать потенциальные риски изменения PL. Погрузите желток в кристаллизатор, содержащий 10 мМ Трис-HCl pH 8, который ранее был охлажден до 4 градусов по Цельсию и удалите область PL над зародышевым диском в пределах 1 см зоны с помощью тупых ножниц(рисунок 2B).ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначально PL был погружен в деионизированную воду, но этот подход имеет некоторые недостатки, такие как отсутствие контроля рН и трудности для отдельных субслой после этого (шаг 1.2). Таким образом, было протестировано несколько условий, включая концентрациюТриса (рисунок 3A)и рН(рисунок 3B). Использование буфера при рН 8, вместо деионизированной или деминерализованной воды, соответствует физиологии яиц (рН яичного белка составляет около 7,8 в день выкладки)14 и сводит к минимуму потерю белка. В отличие от этого, кислый или очень щелочный рН, как сообщается, вызывает PL де-структурации и ранней растворения белка(рисунок 3B). Буфер, состоящий из 10 мМ Трис-HCl рН 8 было установлено, что оптимальный, так как он уважает физиологию яйца и не вызывает значительной солубилизации белка (концентрация белка в рабочем буфере остается минимальной, рисунок 3A,B). Разрыв PL с небольшими ножницами в буфере. Держите два края разорванного PL с типсами и очистить PL от желтка. Поддерживайте PL с типсами и промыть PL несколько раз в нескольких ваннах 10 мМ Tris-HCl, рН 8, пока не будет видно следов желтка. На этом этапе убедитесь, что PL чист, бел и плавает в буфере. Он может быть обработан в шаге 1.2 для разделения подслоя или непосредственно для шага 2.1 для биохимического анализа. Выборка OPL и IPL Распределить весь образец PL, поставив OPL вверх в пластиковую чашку Петри и поддержание его плоским с как можно меньше морщин, как это возможно. Обложка образца с 10 мМ Трис-HCl рН 8, 50 мМ. NaCl. Используйте пластиковую чашку Петри (а не стекло), чтобы ограничить движения PL, потому что PL палочки лучше пластика. Чтобы найти сторону OPL, посмотрите, где расположение остальных chalazae, которые прикреплены к OPL, а не IPL. Этот шаг требует небольшой концентрации NaCl (50 мМ) для облегчения разделения подслой.ПРИМЕЧАНИЕ: На основе графика, представленного на рисунке 3C илитературе 11, эта концентрация не должна привести к значительной потере белка. Первоначально, деионизированная вода была использована для того чтобы отделить sublayers, какописано ранее 1,5,6, но эта техника была найдена, что была очень laborious и привела к в изменении структурной герметичности PL. Таким образом, различные концентрации NaCl (Рисунок 3C) были протестированы, как соль способствовала разделению двух подслоев. Тем не менее, примечательно, что использование концентрации NaCl (gt;100 mM увеличивает солубилизацию/высвобождение белка из PL, что не является целью здесь (это будет целью в шаге 2) (Рисунок 3C). Добавление 50 мM NaCl к буферу 10 мМ Tris-HCl pH 8 облегчает разделение двух подслоев и сводит к минимуму потерю белка. Вырезать общий PL на куски около 2 см х 3 см с небольшими ножницами. Механически отделить два слоя каждого кусок PL с ультра-точный кончик типсов под бинокулярным рассечением микроскопа(рисунок 4). Храните полученные образцы IPL и OPL индивидуально в микротрубочках при -80 градусах Цельсия, до дальнейшего использования.ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Следует отметить, что эффективность и механизм разделения двух слоев во многом зависит от свежести яйца. Действительно, хранящиеся яйца показывают радикальные внутренние изменения в связи с быстрым увеличением рН яичного белка и последующим изменением индекса желтка из-за ослабления PL (и ослабления). IPL является более хрупким по сравнению с OPL. Поэтому предпочтительнее разместить лицо OPL выше и отделить два подслоя, потянув на OPL с типсами. Оба подслоя должны быть обработаны с драгоценной осторожностью. 2. Примеры лечения солубилизации белка и анализа SDS-PAGE Первичная белковая solubilization Заморозка сухих образцов IPL и OPL по отдельности. После замораживания сушки завершена, вырезать приблизительно 1 мг из каждого образца в чистых микротрубок, обладающих утечки доказательство винт крышка. Храните оставшиеся образцы в плотно закрытых трубках для длительного хранения при -80 градусов по Цельсию.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование микротрубок с крышкой винт доказательства утечки обеспечивает герметичное и защитимое от утечки закрытие для предотвращения регидратации образца и что обеспечит образцы. Смешайте 1 мг каждого лиофилизированного подслойщика с 400 МКЛ 50 мм Трис рН 7, 500 мМн NaCl. Используйте смеситель-мельницу в течение 2 раз в течение 5 мин при 30 Гц, чтобы распасть структуры OPL и OPL в микрочастицах и облегчить солубилизацию белка. Соберите 400 МКЛ образцов, содержащих OPL и IPL в двух чистых микротрубочных каналах.ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер, используемый здесь, был выбран для увеличения солубилизации белка (в отличие от шага 1). Этот буфер был основан на результатах, представленных на рисунке 3, которые показывают увеличение белка solubilization на рН 7 (Рисунок 3B) и с использованием 0,5 M NaCl (Рисунок 3C). Протокол можно приостановить здесь. На этом этапе образцы могут быть использованы для очистки белка основных белков PL или обработаны для шага 2.2. Белковая solubilization для электрофореза Добавьте 5x буфер выборки SDS-PAGE (100 йл, 0,25 M Tris-HCl, 0,05% бромофенола синего, 50% глицерол, 5% SDS, 5% бета-меркаптоэтанола, рН 6,8) к каждому 400 йл образца и тепла при температуре 100 градусов по Цельсию за 5 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь, а образцы можно хранить при -80 градусов по Цельсию. На данном этапе протокола OPL и IPL полностью распущены. Эффективность солубилизации образца можно оценить с помощью центрифугирования образцов в течение 5 мин при 10 000 х г. Полная solubilization характеризуется отсутствием видимых гранул после центрифугации. Таким образом, после полной solubilization, считается здесь, что 1 мг лиофилинизированных sublayer соответствует 1 мг белков (концентрация белка в 500 Л образца составляет 2 мг / мл). Действительно, PL состоит из более чем 80% белка2,15. Использование буфера выборки 5x ограничивает разбавление образца, но также может быть использован буфер образца 1x или 2x. Загрузите максимум 20 мкг белков/полосы на полиакриламидный гель SDS (4%-20% градиентного геля) и выполните электрофорез при 120 V с помощью вертикальной электрофорезной системы.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 4%-20% градиентного геля не является обязательным, но предпочтительнее здесь, как OPL и IPL экспонат белков с молекулярными весами, начиная от lt;10 kDa до 250 кДа. Было бы также полезно сохранить укладку геля (который обычно удаляется), так как наличие нерастворимых белков или белковых агрегатов на дне скважин будет указывать на плохую растворимую информацию и возможный недостающий шаг во время подготовки образца. После электрофорез, удалить гели из стеклянных пластин и пятно с Coomassie Блестящий синий раствор (50% H2O, 40% EtOH, 10% уксусной кислоты, и R250 Coomassie Блестящий синий) в течение 30 мин. Де-пятно с раствором, состоящим из 50% H2O, 40% EtOH, 10% уксусной кислоты раствор, пока гель фон появляется светло-голубой. Наконец передать гель в чашках Петри, содержащих деионизированную воду, для достижения де-окрашивания и регидратации полиакриламидных гелей. Белки должны отображаться как синие полосы прозрачного фона.

Representative Results

OPL и IPL были отделены от PL свежеположенного неутвержденного яйца для анализа их белковых профилей SDS-PAGE. Экспериментальный рабочий процесс всего протокола проиллюстрирован на рисунке 2. Рисунок 3 показывает высвобождение белка в различных концентрациях Tris(рисунок 3A), различные рН (рисунок 3B) и различные концентрации NaCl (Рисунок 3C). В результате два sublayers были замечены под светом бинокль рассечения микроскопа и показаны на рисунке 4, где IPL является полупрозрачным в то время как OPL плотный, облачно, и беловатый. Эти функции могут отчасти свидетельствовать об эффективности разделения подслой. После разделения, OPL и IPL были лиофилизированы независимо, и их содержание протеина вполне было растворено спасибо комбинация механически шлифовки, пользы анионового моющего средства (SDS), и уменьшая вещества (бета-меркаптоэтанола), после чего закипая. После миграции в полиакриламинидном геле (SDS-PAGE электрофорез), образцы OPL и IPL демонстрируют различные электрофоретические профили(рисунок 5), как и ожидалось. Рисунок 1: Структура PL свежеотложенного неутилизованного яйца. Схематическая репрезентативная и трансмиссионная электронная микроскопическая микроскопия всего PL в поперечном сечении (личные данные, ©Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique, Университет и CHRU Тура, Франция, С. Джорджо). Обратите внимание, что эта фотография была получена из PL подготовлены, как представлено в этом протоколе. OPL, внешний слой перивиллина; IPL, внутренний слой перивителлина. Черная наконечник стрелы указывает на непрерывную мембрану, разделяющую два подслоя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Рабочий процесс обобщает два основных этапа протокола и примеры приложений. Протокол был оптимизирован для протеомного анализа слоев PL, но он может быть остановлен на некоторых шагах для других приложений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Оптимизация буферного состава для выборки PL. Короче говоря, чистый PL (n No 4) был инкубирован в том же объеме различных буферных растворов в течение 2 ч.PL был удален, и концентрация белка была оценена путем измерения поглощения на 280 нм в оставшемся буфере. (A)Влияние концентрации Tris-HCl при рН 8. (B)Эффект рН (7 к 9). (C)Влияние концентрации NaCl. Из этих результатов мы пришли к выводу, что буфер, состоящий из 10 мМ Трис-HCl, рН 8, 50 мМ НаКл является наиболее подходящим, поскольку он ограничивает потерю белка. Результаты выражаются как среднее ± стандартное отклонение четырех различных образцов PL. Статистический анализ проводился с использованием одной из способов ANOVA с последующим тестом нескольких сравнений Tukey. P-значение lt;0.05 считалось значительным (ns, не значительно; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: OPL и IPL функции под бинокулярным рассечением микроскопа. После разделения IPL (справа) оказался полупрозрачным, а OPL (слева) непрозрачным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: SDS-PAGE анализ отделенных OPL и IPL от свежеотложенных неутяженных неутвержденного яйца. 4%-20% акриламид гель следуют Coomassie блестящий синий окрашивания. Масса молекулярных весовых стандартных полос указана в kDa. Профиль OPL в основном состоит из белков с молекулярной массой 30 кДа, в то время как основные полосы, обнаруженные в профиле IPL, имеют молекулярные массы lt;30 kDa. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Успех настоящего протокола зависит от двух важнейших шагов, которые были независимо оптимизированы: механическое разделение OPL и IPL, которые должны быть как можно менее деструктуризации, а затем полная solubilization белка каждого подслойщика, который, наоборот, деструктуризации и денатурации. В нем также освещаются некоторые конкретные моменты, которые необходимо принимать во внимание для обеспечения успешного достижения каждого шага.

Протокол не зависит от цвета яичной скорлупы, веса яйца, типа производства или генетического штамма курицы. Однако это зависит от свежести яйца. Действительно, яйцо подвергается глубоким внутренним физико-химических изменений быстро после укладки, хотя эти изменения могут быть отложены, когда хранение выполняется вхолодильных условиях 14,15. Потеря двуокиси углерода через поры яичной скорлупы во время хранения приводит к увеличению рН яичного белка (с 7,8 до 9,5), в то время как некоторые водные обмены происходят между желтком и белым, по всей PL. Обе модификации негативно влияют на молекулярную и гистологическую структуру PL, которая становитсяослабленной и менее напряженной 14,15,вероятно, из-за физико-химических измененийее содержания белка 16,17,18. Предполагается, что разделение субслой станет очень трудным с хранящимися яйцами, особенно если хранение проводится в течение длительного периода при комнатной температуре. В настоящее время протокол был выполнен с использованием яиц, хранящихся менее 4 дней при 4 градусов по Цельсию и максимальная продолжительность хранения для яйца эффективно образец PL sublayers пока не известно. Кроме того, если целью является анализ каждого подслойщика, крайне важно использовать неуборотвореные яйца. В день выкладки эмбрион оплодотворенной яйцеклетки составляет 23 ч, после чего его развитие происходит очень быстро, если яйцеклетка инкубируется. Действительно, эмбриональное развитие и рост некоторых внеэмбрионных структур расширяются, используя PL в качестве субстрата, который, таким образом, быстро деградирует, и заменяется экстраэмбрионическим желтчныммешком 19.

После ручного разделения желтка и яичного белка, желток должен быть очищен от следов яичного белка и от chalazae, которые остались плотно прикреплены к PL. Наконечник заключается в том, чтобы аккуратно свернуть желток на фильтровальную бумагу и выполнять обширные моет желтка в буферных растворов (10 мМ Трис-HCl рН 8). РН, используемый для буфера согласуется с физиологическим рН яичного белка14 и было показано, чтобы свести к минимуму потерю белка (Рисунок 3). Использование рефрижераторного буфера поможет удалить PL из желтка, потому что при температуре 4 градусов по Цельсию буфер облегчит удаление PL по мере того, как липидный желток втягивается и становится менее жидким при такой температуре. Дополнительные мойки позволят удалить остатки желтка из PL. Важно также, чтобы вырезать зону, соответствующую зародышевой диск, потому что эта структура, которая содержит женский пронуклей не может быть представителем PL. Это место оплодотворения и умножения эмбриональных клеток при оплодотворении яйцеклетки. Предполагается, что он имеет определенную композицию, которая может не быть репрезентативной для всего PL, что является причиной, почему он был удален. Этот конкретный шаг сильно облегчается, когда желток погружается в холодный буфер. Хотя эта структура зародышевых дисков отбрасывается в настоящем протоколе (из целей), конкретные анализы этой области в оплодотворенных яйцеклеток может быть очень полезным для ученых, заинтересованных в изучении эволюции содержания PL (протеомика и активность) и структуры (электронная микроскопия), на ранних стадияхэмбриогенеза 19,20,21. На данном этапе весь PL структурно не поврежден и может быть обработан для дальнейшего структурного анализа с помощью электронноймикроскопии (рисунок 2),чтобы шаг 1.2 или шаг 2.1 (если цель состоит в том, чтобы проанализировать весь PL).

Шаг 1.2 должен проводиться под бинокулярным рассечением микроскопа, так как PL очень тонкий и хрупкий (около 10 мкм толщиной). Разделение подслоев практически невозможно в воде или в буфере, не хватает минимальной соли, и первоначальные попытки использования этих вариантов привели к серьезному повреждению PL. Таким образом, буфер, выбранный для этого шага, остается на физиологическом рН (рН 8) и содержит 50 мМ НаКл. Этот шаг является трудным и должен быть выполнен тщательно и осторожно, чтобы предотвратить разрыв PL. После того, как разделены, два sublayers могут быть легко идентифицированы, поскольку они проявляют своеобразные физические особенности (непрозрачные по сравнению с полупрозрачными). Отсутствие однородности IPL при свете микроскопа должно отражать неполное разделение и, таким образом, наличие оставшихся пятен OPL, присутствующих на IPL. Кроме того, очень трудно лечить всю мембрану и использование 2 см х 3 см штук значительно повысить шансы на успех. Полученный субслой подходит для гистологического исследования с помощью электронной микроскопии(рисунок 1). Примечательно, что на микрографе (рисунок 1) видна определенная линейная структура (толщиной от 0,05 до1 мкм), названнаянепрерывной мембраной (CM) и которая обычно прикрепляется к одному или другому подслойу в процессе разделения. Ранее было опубликовано, что при использовании относительно высокой молярности соли для разделения (500 мМ), СМ остается прилагается к OPL7 в товремя как использование воды 5 будет способствовать присоединению CM к IPL. В этом протоколе, низкая молярность соли используется для достижения конкретных целей (PL sublayer структурно нетронутыми и минимальная потеря белков), что означает, что этот CM, вероятно, связано с IPL. Тем не менее, дополнительный анализ IPL и OPL с помощью передачи электронной микроскопии будет четко уясню на этой гипотезе. Слои PL, OPL или IPL, полученные в конце шага 1, также могут быть использованы для анализа в пробирке для анализасвязывания сперматозоидов и яйцеклеток 22 или для анализа ранних стадий эмбрионального развития23,24.

Шаг 2 относится к solubilization содержания белка, частично (шаг 2.1) или полностью (шаг 2.2). PL и/или OPL сначала лиофилизированы для удаления молекул воды и для точного измерения веса. Действительно, PL в основном состоит из воды (88%)7, в то время как сухое вещество содержит по существу белки (от 80% до 90% в зависимости от исследований), углеводы, жирыи минералы 2,7,25. Учитывая, что вода, содержащаяся в PL удаляется путем замораживания сушки, что углеводы по существу восстанавливаются в PL гликопротеинов, и что жир и минералы происходят из желтка по существу отбрасываются обширные моет, предполагается, что в результате PL состоит почти исключительно из белков. Таким образом, значение веса, полученное после полной лиофилии, должно в основном соответствовать белкам. Равное количество PL, OPL и/или IPL затем разбавляется в буфере, содержащем 0,5 M NaCl. Высокая молярность соли в сочетании с механическим разрушением волокнистой сети путем измельчения значительно облегчает растворимость белка в условиях, не денатурированных условиях. Этот шаг сопровождается полной solubilization с использованием кипения, моющее средство SDS и снижение агента бета-меркаптоэтанола (шаг 2.2). Действительно, некоторые белки IPL являются SDS-растворимые гликопротеины25,26,27 и основные компоненты OPL являются NaCl-растворимые1,11. Используя этот протокол, мы не увидели никаких оставшихся гранул нерастворимых белков после центрифугации, что указывает на то, что solubilization, вероятно, завершена. Белки из PL, OPL и/или IPL были затем проанализированы SDS-PAGE. В результате белковые профилисогласуются с опубликованной литературой 2,4,11,16, но разрешение и интенсивность сигнала значительно улучшена и гораздо более однородна между различными независимыми пробами IPL и OPL.

Кроме того, количественное сравнение между OPL и IPL делается возможным благодаря точности веса, который мы сделали для соответствующихсубслой 2,7. Кроме того, профили OPL и IPL очень различны и, за исключением слабой полосы на 14 kDa и 75 kDa, оба подслоя PL явно не разделяют полосы, отображающие тот же молекулярный вес. Это наблюдение подтверждает эффективность разделения субслой без существенного перекрестного загрязнения. Согласно единственному pl протеомическомуанализу, опубликованному 1, наиболее интенсивные полосы в OPL (Lt;30 kDa) должны соответствовать лизозиму (14 кДа), вителлиновой мембране внешнего слоя белка 1 (17 кДа), птичьему бета-дефензину 11 (видимый молекулярный вес 12 кДа), в то время как интенсивные полосы IPL (Nogt;30 kDa), вероятно, белка Зона-Pellucida 1 (102 kDa) и белка Зона-Pellucida 3 (47 kDa). Распределение очень обильных белков PL ovotransferrin (78 kDa), овальбумин-родственного белка X (45 kDa), овалбумина (43 kDa)1 между субслойами еще предстоит выяснить. Действительно, высокий молекулярный вес этих белков (Nogt;30 kDa) предполагает, что они IPL белки на основе профиля SDS-PAGE, но их ткани специфичности (oviduct-выраженные белки) скорее ассоциировать эти белки с OPL28,29. Кроме того, некоторые из них предложили потенциальное загрязнение образцов PL яичным белком и яичным желтком белков из-за недостаточного мытья1. Отсутствие информации является основой для разработки настоящего протокола, который будет дополнительно использоваться для углубленной количественной протеомии PL, OPL и IPL.

Кроме того, от шага 2.1 и после центрифугации для удаления нерастворимого вещества, можно извлечь некоторые специфические белки для дальнейшей биохимической и биологической характеристики. Такой подход был недавно применен для характеристики биологической деятельности и / или 3D структуры двух основных компонентов OPL, вителлин мембраны внешнего слоя белка 1 (VMO1) и птичьего бета-дефенсина 11 (AvBD11)30,31. Наличие этих белков в качестве очищенных молекул может также помочь производить специфические антитела для дополнительных экспериментов, таких как иммуногистохимия или для разработки количественных анализов, в том числе фермент-связанных иммуносорбентов анализы.

Двумя основными ограничениями этого протокола являются (1) проблема разделения субслой, особенно если яйца хранились более 4 дней при 4 градусах Цельсия и (2) тот факт, что полная солубилизация белка требует сокращения и денатурации буферов, которые ухудшают внутреннюю биологическую активность полученных образцов. Что касается первого ограничения, механическое разделение требует технических навыков, но легко достигается после 2 или 3 экспериментальных тренингов. Некоторые небольшие кусочки IPL могут оставаться прикрепленными к OPL и наоборот, так как оба подслоя тесно связаны между ею. Однако загрязнение одного подслойщика другим должно быть минимальным, если механическое разделение выполняется осторожно. Типичные профили IPL и OPL SDS-PAGE после оптимального разделения подслойки иллюстрируются на рисунке 5. Что касается второго ограничения, экспериментальные шаги, представленные в этой статье были оптимизированы для протеомного анализа, с тем чтобы обеспечить исчерпывающий список белков, составляя каждый подслой. Для дальнейшей характеристики биологической активности каждого белка необходимо остановиться на шаге 2.1.2, прежде чем использовать денатурированные условия (шаг 2.2.1, использование буфера с SDS и бета-меркаптоэтанол с последующим кипением). Однако следует отметить, что белки, полученные в результате шага 2.1.2, являются только солеорастворимыми белками, в то время как солеово-нерастворимые белки образуют агрегаты. Одним из вариантов дальнейшей оценки их соответствующей активности может быть производство солевых нерастворимых белков в качестве рекомбинантных белков с использованием гетерологических систем(кишечная палочка,бакуловирус, дрожжи и т.д.).

Этот протокол может быть адаптирован к другим птичьим яйцам для сравнительных исследований, чтобы лучше оценить оригинальность каждого вида. Действительно, PL отображает некоторые особенности птиц как структурно, так и с точки зрения состава белка, вероятно, из-за адаптации к новым средам,но и для развития специфики 2,6,9,32. Разработка этого протокола, который требует умеренной техники и классического оборудования/материалов, открывает новые научно-исследовательские направления в области воспроизводства птиц и исследований в области видообразования.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны Филиппу Дидье и Карине Ангер (INRAE, PEAT, 37380, Nouzilly, Франция, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) за предоставление неутвержированных иса-коричневых яиц. Мы также благодарим Университет Туров, Франция за финансирование докторской степени М. Брегеона. Эта работа получила финансовую поддержку от Французского национального исследовательского агентства (ЭЗЛИПСЕ, ANR-19-CE21-0006).

Materials

Binocular dissecting microscope Vision Engineering, France Model Mantis Elite
Lyophilizer Cryotec, France Model Cosmos 80
Mini-Protean II electrophoresis cell Biorad, Hercules, USA 1652960 Any apparatus adapted for protein electrophoresis
Mixer Mill MM400 Retsch, Hann, Germany 20.745.0001 Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample
Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm Dutscher, Brumath 5066
Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm Dutscher, Brumath 327005
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mann, K. Proteomic analysis of the chicken egg vitelline membrane. Proteomics. 8 (11), 2322-2332 (2008).
  2. Chung, W. H., Lai, K. M., Hsu, K. -. C. Comparative study on histological structures of the vitelline membrane of hen and duck egg observed by cryo-scanning electron microscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (3), 1794-1799 (2010).
  3. Kido, S., Doi, Y. Separation and Properties of the Inner and Outer Layers of the Vitelline Membrane of Hen’s Eggs. Poultry Science. 67 (3), 476-486 (1988).
  4. Steele, M. G., Meldrum, W., Brillard, J. P., Wishart, G. J. The interaction of avian spermatozoa with the perivitelline layer in-vitro and in-vivo. Journal of Reproduction and Fertility. 101 (3), 599-603 (1994).
  5. Bain, J. M., Hall, J. M. Observations on the development and structure of the vitelline membrane of the hen’s egg: an electron microscope study. Australian Journal of Biological Sciences. 22 (3), 653-665 (1969).
  6. Damaziak, K., Kieliszek, M., Buclaw, M. Characterization of structure and protein of vitelline membranes of precocial (ring-necked pheasant, gray partridge) and superaltricial (cockatiel parrot, domestic pigeon) birds. PLoS One. 15 (1), 0228310 (2020).
  7. Bellairs, R., Harkness, M., Harkness, R. D. The vitelline membrane of the hen’s egg: a chemical and electron microscopical study. Journal of Ultrastructure Research. 8 (3-4), 339-359 (1963).
  8. Kido, S., et al. Characterization of vitelline membrane outer layer protein I, VMO-I: amino acid sequence and structural stability. Journal of Biochemistry. 117 (6), 1183-1191 (1995).
  9. Damaziak, K., et al. Comparative analysis of structure and strength of vitelline membrane and physical parameters of yolk of ostrich, emu, and greater rhea eggs. Poultry Science. 97 (3), 1032-1040 (2018).
  10. Kirunda, D. F., McKee, S. R. Relating quality characteristics of aged eggs and fresh eggs to vitelline membrane strength as determined by a texture analyzer. Poultry Science. 79 (8), 1189-1193 (2000).
  11. Back, J. F., Bain, J. M., Vadehra, D. V., Burley, R. W. Proteins of the outer layer of the vitelline membrane of hen’s eggs. Biochimica Et Biophysica Acta. 705 (1), 12-19 (1982).
  12. Waclawek, M., Foisner, R., Nimpf, J., Schneider, W. J. The chicken homologue of zona pellucida protein-3 is synthesized by granulosa cells. Biology of Reproduction. 59 (5), 1230-1239 (1998).
  13. Okumura, H., et al. A newly identified zona pellucida glycoprotein, ZPD, and dimeric ZP1 of chicken egg envelope are involved in sperm activation on sperm-egg interaction. Biochemical Journal. 384, 191-199 (2004).
  14. Guyot, N., Rehault-Godbert, S., Nys, Y., Baron, F., Roberts, J. Understanding the natural antibacterial defences of egg white and their regulation. Achieving Sustainable Production of Eggs Volume 1. 1, 161-193 (2016).
  15. Trziszka, T., Smolinska, T. Chemical Characterization of the Vitelline Membrane of Hens Eggs. Food Chemistry. 8 (1), 61-70 (1982).
  16. Berardinelli, A., Ragni, L., Giunchi, A., Gradari, P., Guarnieri, A. Physical-mechanical modifications of eggs for food-processing during storage. Poultry Science. 87 (10), 2117-2125 (2008).
  17. Kelley, A. J. The effects of storage time on vitelline membrane protein banding patterns and interior egg quality of eggs from nonmolted and molted hens. Texas A&M University. , (2003).
  18. Schafer, A., Drewes, W., Schwagele, F. Analysis of vitelline membrane proteins of fresh and stored eggs via HPLC. Zeitschrift Für LebensmittelUntersuchung Und-Forschung A. Food Research and Technology. 206 (5), 329-332 (1998).
  19. Romanoff, A. L. . The avian embryo: Structural and functional development. , (1960).
  20. Haas, H. J., Spratt, N. T. Contributions to an analysis of the avian vitelline membrane’s potential to promote outgrowth of the yolk sac-serosal membrane. The Anatomical Record. 184 (2), 227-231 (1976).
  21. Jensen, C. Ultrastructural changes in the avian vitelline membrane during embryonic development. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 21 (3), 467-484 (1969).
  22. Barbato, G. F., Cramer, P. G., Hammerstedt, R. H. A practical in vitro sperm-egg binding assay that detects subfertile males. Biology of Reproduction. 58 (3), 686-699 (1998).
  23. New, D. A. T. The Adhesive Properties and Expansion of the Chick Blastoderm. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 7 (2), 146-164 (1959).
  24. New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3 (4), 326-331 (1955).
  25. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen’s egg. I. Membrane structure and its deterioration with age. Journal of Biochemistry. 78 (2), 261-268 (1975).
  26. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen’s egg. II. Physicochemical properties of glycoprotein I. Journal of Biochemistry. 79 (6), 1351-1356 (1976).
  27. Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen’s egg. III. Physicochemical properties of glycoprotein II. Journal of Biochemistry. 81 (5), 1543-1548 (1977).
  28. Réhault-Godbert, S., et al. Ovalbumin-related protein X is a heparin-binding ov-serpin exhibiting antimicrobial activities. Journal of Biological Chemistry. 288 (24), 17285-17295 (2013).
  29. Gautron, J., et al. Ovotransferrin is a matrix protein of the hen eggshell membranes and basal calcified layer. Connective Tissue Research. 42 (4), 255-267 (2001).
  30. Guyot, N., et al. Proteomic analysis of egg white heparin-binding proteins: towards the identification of natural antibacterial molecules. Scientific Reports. 6, 27974 (2016).
  31. Guyot, N., et al. function, and evolution of Gga-AvBD11, the archetype of the structural avian-double-beta-defensin family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 337-345 (2020).
  32. Mori, M., Masuda, N. Proteins of the vitelline membrane of quail (Coturnix coturnix japonica) eggs. Poultry Science. 72 (8), 1566-1572 (1993).

Tags

Perivitelline MembranePerivitelline LayerOuter Perivitelline LayerInner Perivitelline LayerHen’s EggsEgg YolkEgg WhiteChalazaeProtein SolubilizationProteomicsMechanical SeparationTris-HCl BufferSodium ChlorideFreeze-dryingProtein Extraction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bregeon, M., Guyot, N., Réhault-Godbert, S. Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen’s Eggs. J. Vis. Exp. (167), e61739, doi:10.3791/61739 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image