4D Mikroskopi: Nomarski Mikroskobu Kullanarak Caenorhabditis elegans Embriyonik Gelişiminin Çözülmesi
Summary
Burada, Caenorhabditis elegans embriyolarının hazırlanması ve monte edilmesi, 4D mikroskop altında gelişimin kaydedilmesi ve hücre soyunun izlenmesi için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
4D mikroskopi, farklı hayvanlarda embriyonik gelişim sürecini çözmek için paha biçilmez bir araçtır. Son yıllarda, Caenorhabditis elegans , gelişimi incelemek için en iyi modellerden biri olarak ortaya çıkmıştır. Optik açıdan bakıldığında, boyutu ve şeffaf gövdesi bu nematodu DIC (Diferansiyel Girişim Kontrastı veya Nomarski) mikroskopisi için ideal bir örnek haline getirir. Bu makalede, C. elegans nematodlarının yetiştirilmesi, embriyolarının hazırlanması ve monte edilmesi, 4D mikroskopi ve hücre soyağacı takibinin yapılması için bir protokol gösterilmektedir. Yöntem, Nomarski görüntülerinin çok odaklı hızlandırılmış kayıtlarına ve belirli bir yazılımla yapılan analizlere dayanmaktadır. Bu teknik, hücresel düzeyde embriyonik gelişim dinamiklerini ortaya koymaktadır. Iğ oryantasyonundaki problemler, hücre göçü, apoptoz veya hücre kaderi spesifikasyonu gibi mutantlardaki herhangi bir embriyonik kusur etkili bir şekilde tespit edilebilir ve puanlanabilir. Embriyonun hemen hemen her bir hücresi, embriyonun hareket etmeye başladığı ana kadar takip edilebilir. Bir C. elegans embriyosunun tüm hücre soyunun 4D DIC mikroskopisi ile izlenmesi zahmetlidir, ancak belirli bir yazılımın kullanılması bu görevi büyük ölçüde kolaylaştırır. Ek olarak, bu tekniğin laboratuvarda uygulanması kolaydır. 4D mikroskopi çok yönlü bir araçtır ve embriyonik gelişimin benzersiz bir analizini yapma olasılığını açar.
Introduction
4D mikroskopi, araştırmacıların biyolojik bir numunenin hücre dinamiklerini hem mekansal hem de zaman içinde kaydetmelerini ve ölçmelerini sağlayan çok odaklı bir hızlandırılmış kayıt sistemidir. Hücre kültürleri, mayalar veya canlı dokular 4D analize tabi tutulabilir, ancak bu teknik özellikle canlı embriyoların gelişimini analiz etmek için uygundur. Bu analizin çözünürlüğü, embriyonun her bir hücresinin seviyesine ulaşır. Her hücre bölünmesi tespit edilebilir ve hücre hareketleri zamanla izlenebilir. Hücre kaderleri, hücrelerin kazandığı konum ve şekle göre değerlendirilir. Nomarski optiklerinin kullanımı, odak düzlemine müdahale eden ortogonal polarize ışık huzmeleri kullanarak lekesiz şeffaf numunelerin kontrastını arttırır. Elde edilen görüntüler üç boyutlu görünür, bir tarafta aydınlatılır.
Çekirdeklerin otomatik tespiti ve hücre soylarının oluşturulması için konfokal mikroskopi ve GFP transgenik hayvanların kullanımına dayanan diğer yöntemler geliştirilmiştir 1,2. Bu sistemlerin avantajı açıktır: Yazılım, her çekirdeği belirli bir süre boyunca manuel olarak işaretleme ihtiyacını büyük ölçüde geçersiz kılar (geç aşamalarda bazı manuel denetimler gerekmesine rağmen). Bununla birlikte, hücre farklılaşması, göç, apoptoz veya ceset yutulması sırasında meydana gelenler gibi hücre şekli veya membran dinamiklerindeki değişiklikleri içeren hücresel süreçler, floresan etiketli çekirdek görüntülerinde siyah bir arka plan olarak gizli kalır.
Buna karşılık, 4D Nomarski mikroskobu (DIC mikroskobu, Diferansiyel Girişim Kontrast mikroskobu olarak da adlandırılır), vahşi tip veya mutant hayvanların gelişimi sırasında meydana gelen hem çekirdekleri hem de hücre şekli değişikliklerini gösterir. Bu, standart mikroskoplar kullanarak hücre soyağacı izlemesine izin verir ve yalnızca iletilen ışığı kullanır. Belirli ifade kalıplarını göstermek dışında transgenik hayvanları kullanmaya genel bir ihtiyaç yoktur, bu durumda floresan taramaları birbirine karışabilir. Bu nedenle, bu, DIC mikroskobu 3,4,5,6,7 altında vurgulanabilen embriyogenez veya apoptoz gibi dinamik hücre süreçleri üzerinde çalışan birçok laboratuvar için en uygun yaklaşım olabilir.
Mikroskobik görüntüleri yakalamak ve kaydedilen örnekte hücre soylarını, 3B modelleri, hücre geçiş yollarını vb. Yeniden yapılandırmak için çeşitli esnek ve kullanıcı dostu programlar mevcuttur. Standart bir deneyde, görüntüler, sayısı numune kalınlığına bağlı olan sabit bir mesafede, bir dizi odak düzleminde elde edilir. Analizin zamansal çözünürlüğü, tarama sıklığı artırılarak optimize edilebilir. Kayıt süresi için bilgisayar depolama kapasitesi dışında neredeyse hiçbir sınır yoktur. Örneğin, bir C. elegans embriyo gelişim analizi için, 12 saat boyunca her 30 saniyede bir 30 odak düzleminde (her biri 1 mikron adım) rutin olarak görüntüler elde ediyoruz.
Bu sistemler, Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster 11, diğer nematod embriyoları12,13, tardigradlar 14,15 ve hatta erken fare embriyoları 16 gibi çeşitli hayvan embriyolarının analizine uygulanmıştır. Tek şart, mikroskop altında slayt hazırlığında gelişebilen şeffaf bir embriyoya sahip olmaktır.
Özetle, DIC tabanlı 4D mikroskopi özellikle 1) küçük, şeffaf hayvanların embriyonik gelişimini analiz etmek için yararlıdır: hücre soyunun, hücre göç yollarının izlenmesi, 3D modellerin oluşturulması, vb. 2) gen ekspresyon kalıplarını tanımlamak; 3) mayadan insan hücrelerine kadar hücre kültürü dinamiklerini incelemek; 4) doku dinamiklerini veya embriyo parçalarını analiz etmek; 5) hücre ölümü kinetiğini ve ceset yutulmasını ölçmek; ve 6) embriyonik gelişimsel özelliklere dayalı karşılaştırmalı filojeni analizi yapmak. Bu konulardan herhangi birine (veya benzerlerine) ilgi varsa, 4D mikroskopi kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modern biyolojideki en büyük zorluklardan biri, çok hücreli organizmaların gelişimini anlamaktır. C. elegans, gelişmekte olan embriyoda hücre çoğalması ve hücre farklılaşması arasındaki ince koordinasyonu incelemek için en uygun modellerden biri olarak ortaya çıkmıştır. Optik açıdan bakıldığında, şeffaf gövdesi ve küçük boyutu bu nematodu DIC mikroskobu için ideal bir örnek haline getirir. Benzer özelliklere sahip diğer organizmalar da 4D mikroskopi analizine tabi tutulmuştur 11,12,13,14,15,16.
Bu gelişimsel çalışmalar için, ileri veya geri genetik ile gen inaktivasyonu, embriyogenezdeki katılımına dair bir ipucu sağlar. Bir genin gelişimde rol oynadığı kanıtlandıktan sonra, bir sonraki adım, doğru vücut planının oluşturulmasındaki rolünü tanımlamaktır. İmmün boyama çoğu model için seçilen yaklaşımdır. Bu teknik, hücre farklılaşmasındaki veya spesifik belirteçlerin ekspresyonundaki sorunları aydınlatır. Bununla birlikte, bu yaklaşımın önemli bir sınırlaması, yalnızca gelişimin sabit bir noktasında tek veya daha fazla işaretleyicinin ifadesinin statik bir görünümünü sağlamasıdır. Bu belirteçlerin gelişim boyunca dinamik bir görünümü ancak farklı embriyoların farklı zaman noktalarında boyanmasıyla elde edilebilir. Ek olarak, bu tür sabit örneklerde hücre soyu rekonstrüksiyonu mümkün değildir.
4D mikroskopi, embriyonik gelişimi incelemek için tamamlayıcı bir yaklaşımdır. Bu teknik, hücre düzeyinde çözünürlükte gelişim dinamiklerini ortaya koymaktadır. Embriyodaki iğ oryantasyonundaki problemler, hücre göçü, apoptoz, hücre kaderi spesifikasyonu gibi herhangi bir kusur, araştırmacı tarafından ileri ve geri görselleştirilebilen, nicelleştirilebilen ve puanlanabilen bir 4D filmde ortaya çıkacaktır. Bu tekniği kullanarak, embriyodaki hemen hemen her hücre, embriyonun hareket etmeye başladığı ana kadar takip edilebilir. Sadece görünür ışık ve Nomarski optikleri ile 4D mikroskopiye tabi tutulan embriyolar fotohasara maruz kalmaz. Floresan taramalar, bir genin ne zaman ve nerede ifade edildiğini tespit etmek için kayıt içinde de birleştirilebilir. Önemli fotohasara maruz kalan embriyolar, standart bir WT soy embriyosuna kıyasla güçlü UV ışınlamasına neden olan hücre döngüsü uzantısı ile tanımlanır. Bu durumda, UV lamba yoğunluğunu düşürerek ve kamera hassasiyetini veya pozlama süresini artırarak fotohasar azaltılabilir. Morfolojik özellikler ve moleküler belirteçler, herhangi bir mutantın embriyonik gelişimini netleştirmeye yardımcı olabilir.
Bir 4D mikroskopi sisteminin kurulması laboratuarda uygulanması kolaydır ve bazı uygulamalardan sonra, hücre dinamiklerinin eşsiz bir analizini ve hücre kültürlerinin soy izlemesini ve mikroskop alanındaki her hücrenin çözünürlük seviyesinde yaşayan şeffaf örnekleri mümkün kılar. DIC görüntülerinde hücre soyağacı izleme hala elle işlenir. Zaman alıcıdır ve yazılım aynı hücreyi işaretleyen farklı soy dalları gibi soy hatalarını tespit etse de, hatalar mümkündür. GFP etiketli hücrelerin otomatik tespiti iyi geliştirilmiş2 olsa da, işaretsiz hücrelere ve görünür ışık görüntülerine dayanan tamamlayıcı soy izleme yazılımı hala erken aşamadadır ve tam bir embriyo analizi için gerçekten yararlı değildir. Hiç şüphesiz görüntü tanıma sistemlerinin görünür ışık mikroskobu alanına uygulanması bu alanda büyük bir ilerlemeyi beraberinde getirecektir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Rioja Salud Vakfı (Fondos FEDER) ve İspanya Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00) desteğine teşekkür etmek istiyor. Cristina Romero Aranda, AECC’den (Asociación Española Contra el Cáncer) bir burs ile finanse edilmektedir.
Materials
| Caenorhabditis elegans (N2) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | N2 | WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis elegans (VZ454) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | VZ454 | gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Cell Lineage Tracing software | SIMI | Simi BioCell | This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html |
| Microscope camera | Hamamatsu | Orca-R2 | Miscroscope camera for both transmitted and UV light |
| Microscope control software | Caenotec | Time to Live | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 Börßum, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de |
| Microscope control software | Micro-manager | Micro-manager | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/ |
| Motorized microscope | Leica | Leica DM6000 | Motorized upright microscope to perform 4D microscopy |
| Standard equipment in a Molecular Biology lab. | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZ16FA | Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos. |
References
- Hardin, J. Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).
- Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).
- Nieto, C., et al. ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans. Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).
- Cabello, J., et al. PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans. Cell Death & Disease. 5, 1120 (2014).
- Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).
- Sáenz-Narciso, B., Gómez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated. Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).
- Zheleva, A. Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development. PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).
- Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software. Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).
- Boyd, L., Hajjar, C., O’Connell, K. Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).
- Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila. Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).
- Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata). Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).
- Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina. Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).
- Hejnol, A., Schnabel, R. The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations. Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).
- Hejnol, A., Schnabel, R. What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development. Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).
- Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions. Development. 135 (5), 953-962 (2008).
- Mora-Lorca, J. A. Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development. Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).
