4D-microscopie: Caenorhabditis elegans embryonale ontwikkeling ontrafelen met behulp van Nomarski-microscopie
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het voorbereiden en monteren van Caenorhabditis elegans-embryo’s , het registreren van de ontwikkeling onder een 4D-microscoop en het traceren van de cellijn.
Abstract
4D-microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het ontrafelen van het embryonale ontwikkelingsproces bij verschillende dieren. In de afgelopen decennia is Caenorhabditis elegans naar voren gekomen als een van de beste modellen voor het bestuderen van ontwikkeling. Vanuit optisch oogpunt maken de grootte en het transparante lichaam deze nematode een ideaal monster voor DIC (Differential Interference Contrast of Nomarski) microscopie. Dit artikel illustreert een protocol voor het kweken van C. elegans-nematoden , het voorbereiden en monteren van hun embryo’s, het uitvoeren van 4D-microscopie en het traceren van cellijn. De methode is gebaseerd op multifocale time-lapse records van Nomarski-beelden en analyse met specifieke software. Deze techniek onthult embryonale ontwikkelingsdynamiek op cellulair niveau. Elk embryonaal defect in mutanten, zoals problemen in spindeloriëntatie, celmigratie, apoptose of celbestemmingsspecificatie, kan efficiënt worden gedetecteerd en gescoord. Vrijwel elke cel van het embryo kan worden gevolgd tot het moment dat het embryo begint te bewegen. Het traceren van de volledige cellijn van een C. elegans-embryo door 4D DIC-microscopie is bewerkelijk, maar het gebruik van specifieke software vergemakkelijkt deze taak aanzienlijk. Bovendien is deze techniek eenvoudig te implementeren in het lab. 4D-microscopie is een veelzijdig hulpmiddel en opent de mogelijkheid om een ongeëvenaarde analyse van de embryonale ontwikkeling uit te voeren.
Introduction
4D-microscopie is een multifocaal time-lapse-registratiesysteem waarmee onderzoekers de celdynamiek van een biologisch monster zowel ruimtelijk als in de loop van de tijd kunnen registreren en kwantificeren. Celculturen, gisten of levende weefsels kunnen worden onderworpen aan 4D-analyse, maar deze techniek is vooral geschikt voor het analyseren van de ontwikkeling van levende embryo’s. De resolutie van deze analyse bereikt het niveau van elke afzonderlijke cel van het embryo. Elke celdeling kan worden gedetecteerd en celbewegingen kunnen in de loop van de tijd worden getraceerd. Celbestemmingen worden beoordeeld op basis van de positie en vorm die cellen krijgen. Het gebruik van Nomarski-optica verbetert het contrast van niet-gekleurde transparante monsters met behulp van orthogonaal gepolariseerde lichtstralen die interfereren in het brandpuntsvlak. De resulterende beelden zien er driedimensionaal uit, aan één kant verlicht.
Andere methoden gebaseerd op het gebruik van confocale microscopie en GFP transgene dieren voor automatische detectie van kernen en het genereren van cellijnen zijn ontwikkeld 1,2. Het voordeel van die systemen is duidelijk: de software overschrijft ruimschoots de noodzaak om elke kern gedurende een bepaalde periode handmatig te markeren (hoewel enige handmatige supervisie vereist is in de late stadia). Cellulaire processen met veranderingen in celvorm of membraandynamica, zoals die optreden tijdens celdifferentiatie, migratie, apoptose of lijkoverspoeling, blijven echter verborgen als een zwarte achtergrond in de fluorescerend gelabelde kernafbeeldingen.
Daarentegen toont 4D Nomarski-microscopie (ook wel DIC-microscopie, Differential Interference Contrast-microscopie) zowel kern- als celvormveranderingen die optreden tijdens de ontwikkeling van wilde of gemuteerde dieren. Dit maakt het traceren van de afstamming mogelijk met behulp van standaard microscopen, waarbij alleen doorgelaten licht wordt gebruikt. Er is geen algemene noodzaak om transgene dieren te gebruiken, behalve om specifieke expressiepatronen te vertonen, in welk geval fluorescerende scans kunnen worden geïntercaleerd. Daarom zou dit de optimale aanpak kunnen zijn voor veel laboratoria die werken aan dynamische celprocessen zoals embryogenese of apoptose die kunnen worden benadrukt onder DIC-microscopie 3,4,5,6,7.
Verschillende flexibele en gebruiksvriendelijke programma’s zijn beschikbaar voor het vastleggen van microscopische beelden en het reconstrueren van cellijnen, 3D-modellen, celmigratiepaden, enz. in het opgenomen monster. In een standaardexperiment worden beelden verkregen in een reeks brandpuntsvlakken, op een constante afstand, waarvan het aantal afhankelijk is van de dikte van het monster. De temporele resolutie van de analyse kan worden geoptimaliseerd door de scanfrequentie te verhogen. Er is vrijwel geen limiet voor de duur van de opname anders dan de opslagcapaciteit van de computer. Voor een C. elegans embryo-ontwikkelingsanalyse verkrijgen we bijvoorbeeld routinematig beelden op 30 brandpuntsvlakken (elk 1 micron-stap), elke 30 seconden gedurende 12 uur.
Deze systemen zijn toegepast op de analyse van verschillende dierlijke embryo’s zoals Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, andere aaltjesembryo’s12,13, beerdiertjes14,15 en zelfs vroege muizenembryo’s16. De enige vereiste is het hebben van een transparant embryo dat zich kan ontwikkelen op het glaaspreparaat onder de microscoop.
Samenvattend is DIC-gebaseerde 4D-microscopie vooral nuttig voor 1) het analyseren van de embryonale ontwikkeling van kleine, transparante dieren: het traceren van cellijn, celmigratiepaden, het genereren van 3D-modellen, enz.; 2) het definiëren van genexpressiepatronen; 3) het bestuderen van celkweekdynamiek, van gist tot menselijke cellen; 4) het analyseren van weefseldynamica of embryofragmenten; 5) kwantificering van de kinetiek van celdood en lijkoverspoeling; en 6) het uitvoeren van vergelijkende fylogenieanalyse op basis van embryonale ontwikkelingskenmerken. Als er interesse is in een van deze onderwerpen (of soortgelijke onderwerpen), kan 4D-microscopie worden gebruikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een van de grootste uitdagingen in de moderne biologie is het begrijpen van de ontwikkeling van meercellige organismen. C. elegans is naar voren gekomen als een van de meest geschikte modellen voor het bestuderen van de fijne coördinatie tussen celproliferatie en celdifferentiatie in het zich ontwikkelende embryo. Vanuit optisch oogpunt maken het transparante lichaam en het kleine formaat deze nematode een ideaal monster voor DIC-microscopie. Andere organismen met vergelijkbare kenmerken zijn ook onderworpen aan 4D-microscopieanalyse 11,12,13,14,15,16.
Voor die ontwikkelingsstudies biedt geninactivatie door voorwaartse of omgekeerde genetica een aanwijzing voor zijn betrokkenheid bij embryogenese. Zodra is bewezen dat een gen een rol speelt in de ontwikkeling, is de volgende stap het definiëren van de exacte rol in het opstellen van het juiste lichaamsplan. Immunostaining is de gekozen aanpak voor de meeste modellen. Deze techniek verheldert problemen in celdifferentiatie of expressie van specifieke markers. Een belangrijke beperking van deze benadering is echter dat het alleen een statisch beeld geeft van de expressie van een enkele of meer markers op een vast punt in ontwikkeling. Een dynamisch beeld van deze markers gedurende de ontwikkeling kan alleen worden verkregen door verschillende embryo’s op verschillende tijdstippen te kleuren. Bovendien is cellijnreconstructie niet mogelijk in dergelijke vaste monsters.
4D-microscopie is een aanvullende benadering voor het bestuderen van embryonale ontwikkeling. Deze techniek onthult ontwikkelingsdynamiek op celniveau. Elk defect in het embryo, zoals problemen in spindeloriëntatie, celmigratie, apoptose, specificatie van het lot van cellen, enz., Zal verschijnen in een 4D-film die vooruit en achteruit kan worden gevisualiseerd, gekwantificeerd en gescoord door de onderzoeker. Met behulp van deze techniek kan vrijwel elke cel in het embryo worden gevolgd tot het moment dat het embryo begint te bewegen. Embryo’s die worden onderworpen aan 4D-microscopie met alleen zichtbaar licht en Nomarski-optica lopen geen fotoschade op. Fluorescerende scans kunnen ook worden geïntercaleerd in de opname om te detecteren wanneer en waar een gen tot expressie wordt gebracht. Embryo’s die aanzienlijke fotoschade lijden, worden geïdentificeerd door de celcyclusverlenging die sterke UV-bestraling veroorzaakt in vergelijking met een standaard WT-afstammingsembryo. In dat geval kan fotoschade worden verminderd door de intensiteit van de UV-lamp te verlagen en de gevoeligheid of belichtingstijd van de camera te verhogen. Morfologische kenmerken en moleculaire markers kunnen helpen de embryonale ontwikkeling van elke mutant te verduidelijken.
Het opzetten van een 4D-microscopiesysteem is eenvoudig te implementeren in het laboratorium en maakt, na enige oefening, een ongeëvenaarde analyse van celdynamica en afstammingstracering van celculturen en levende transparante monsters mogelijk op een resolutieniveau van elke cel in het microscoopveld. Cellijntracering op DIC-beelden wordt nog steeds met de hand verwerkt. Het is tijdrovend en hoewel de software afstammingsfouten detecteert, zoals verschillende afstammingstakken die dezelfde cel markeren, zijn fouten mogelijk. Hoewel automatische detectie van GFP-gelabelde cellen goed ontwikkeld is2, is aanvullende afstammingstraceringssoftware op basis van ongemarkeerde cellen en zichtbare lichtbeelden zich nog in een vroeg stadium en niet echt nuttig voor een volledige embryo-analyse. Zonder enige twijfel zal de toepassing van beeldherkenningssystemen op het gebied van zichtbaar lichtmicroscopie een grote vooruitgang op dit gebied teweegbrengen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de steun erkennen van de Rioja Salud Foundation (Fondos FEDER) en het Spaanse Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda wordt gefinancierd door een fellowship van de AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).
Materials
| Caenorhabditis elegans (N2) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | N2 | WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis elegans (VZ454) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | VZ454 | gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Cell Lineage Tracing software | SIMI | Simi BioCell | This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html |
| Microscope camera | Hamamatsu | Orca-R2 | Miscroscope camera for both transmitted and UV light |
| Microscope control software | Caenotec | Time to Live | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 Börßum, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de |
| Microscope control software | Micro-manager | Micro-manager | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/ |
| Motorized microscope | Leica | Leica DM6000 | Motorized upright microscope to perform 4D microscopy |
| Standard equipment in a Molecular Biology lab. | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZ16FA | Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos. |
References
- Hardin, J. Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).
- Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).
- Nieto, C., et al. ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans. Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).
- Cabello, J., et al. PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans. Cell Death & Disease. 5, 1120 (2014).
- Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).
- Sáenz-Narciso, B., Gómez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated. Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).
- Zheleva, A. Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development. PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).
- Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software. Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).
- Boyd, L., Hajjar, C., O’Connell, K. Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).
- Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila. Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).
- Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata). Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).
- Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina. Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).
- Hejnol, A., Schnabel, R. The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations. Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).
- Hejnol, A., Schnabel, R. What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development. Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).
- Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions. Development. 135 (5), 953-962 (2008).
- Mora-Lorca, J. A. Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development. Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).
