4D顕微鏡:ノマルスキ顕微鏡を用いた カエノラブディティス・エレガンス 胚発生の解明

1.ペトリ皿で C.エレガンス を育てる NGMプレートを用意し、大腸菌OP50を食物源として播種する(図1)。17に記載されているようにC.エレガンスを成長させ、維持する。播種したプレートを4°Cで最大1ヶ月間保管する。 ワームを追加する前にプレートを所望の温度に調整する。 ワームを移すには、古いプレートから寒天の塊を取り除き、それを新しいプレートに置きます。 あるいは、滅菌ワームピッカー(パスツールピペットの先端に取り付けられた、平らな先端を持つ1インチの32ゲージプラチナワイヤー)で単一の動物を捕獲し、新しいプレートに置きます。 所望の温度でワームを育てる。 C.エレガンスワームを標準温度である20°Cで成長させる。しかしながら、熱感受性変異体の発達を分析するには、通常25°Cで一晩インキュベーションを行う。 このインキュベーションの持続時間と温度は、必要に応じて、特定の変異体に応じて調整します。 2. 胚を装着する前に4D顕微鏡記録を準備する(図2) 胚を準備する前に顕微鏡と温度制御をセットアップします。 C.エレガンス 胚は非常に迅速に分裂する。胚を装着した直後に記録を開始する準備をしてください。 記録温度を15°C、20°C、または25°Cに調整します。 25°Cで胚を日常的に記録する。 温度感受性変異体を制限温度で記録し、その表現型を示す。WTコントロールを変異体と同じ温度で記録する(別の調製物で行われた場合)。注:WT胚は、細胞系譜にさらなる違いを生じることなく、25°Cでより速く、15°Cで遅く発達する。温度管理された部屋に顕微鏡を置きます。スライドを冷却または加熱することによる追加の制御が非常に望ましい。これは、顕微鏡対物レンズおよび凝縮器の周りの金属リングを通して特定の温度の水を循環させることによって達成することができる。目的と調製物は浸漬油を介して直接接触し、温度移動は効率的である。このシステムは、記録温度の正確な制御を可能にし、胚発生中に温度シフトを実行することを可能にする。 顕微鏡ソフトウェアで記録パラメータを定義します。 標準的な C. elegans 記録(蛍光スキャンなし)の場合、以下を選択します。それぞれ1ミクロンの距離にある30の焦点面のzスタック。各 Z スタックの先頭間の 30 秒間隔。1500 の Z スタック (12.5 時間のレコード)。注:商用顕微鏡制御プログラムとオープンソース顕微鏡制御プログラムの両方を使用して、画像をキャプチャするためのこのワークフローを定義できます。これで顕微鏡は記録する準備ができました。 3.胚を準備してマウントする 薄い均質な寒天パッドを、素敵な画像を得るための最初のステップとして準備します(図3)。 脱イオン水中に4.5%寒天溶液50mlを調製する。電子レンジで沸騰するまで加熱し、0.5 – 1 mlを3 mlのガラス管に注ぎます。 乾燥を避けるために、チューブをワックスフィルムで慎重に密封してください。密封された寒天管は、室温で最大2ヶ月間保存することができる。 ラボベンチに、80°Cのヒートブロックを取り付けます。純粋なワセリン(溶融)の試験管で、内部に細かいペイントブラシが付いています。パスツールピペットを含む蒸留水を含む試験管。注:これにより、必要なすべての材料が高温になり、寒天がパッドを作る過程で固化しないことが保証されます。 寒天管の1つの上部からワックスフィルムを取り出し、アルコールバーナーで慎重に加熱して寒天を溶かします。ガラス管から排出された熱い寒天は火傷を引き起こす可能性があるため、注意してください。 寒天が溶けたら、チューブをヒートブロックに入れて寒天を液体の形に保ちます。 あるいは、実験前のヒートブロック1hに寒天管を入れ、バーナーを用いずに溶かした。溶けた寒天は1日後に捨てるべきです。 顕微鏡スライド(スライドA)をプラスチック片の上に他の2つのスライドの間に置きます。 別のスライド (スライド B) を取り、片手で指で持ちます。 一方、温かいパスツールピペットを使用して、スライドAの中央に溶けた寒天の小さな滴を置きます。 すぐにスライド B を寒天ドロップに押し付けて、スライド A とスライド B の間に非常に薄いパッドを作成します。手順 3.2.3 まで、これらのスライドを挟み込んだままにします。 胚をマウントします。 ピッカーで5〜10個のグラビッド雌雄同体を集め、水で満たされた時計職人のガラスに入れます。 メスを使用して雌雄同体線虫を切り開き、実体顕微鏡下で子宮から初期の卵(1〜4細胞)を抽出する。 手順 3.1.10 のスライドを取り出し、スライド B をそっとスライド オフにして、スライド A の寒天パッドを露出させます。 毛細管でピすることによって寒天パッドの中央に初期の卵を置く。 あるいは、胚のセットを含む一滴を寒天パッド上にピペットで移し、次いで初期段階の胚を検索する。このステップを実体顕微鏡下で行います。 必要に応じて、爪楊枝の端に接着したまつげで卵を動かします。 キャピラリーピペットで余分な水分を取り除きます。注:キャピラリーピペットは、パスツールピペットをアルコールバーナーで加熱し、両端から引っ張ることで簡単に準備できます。 準備をカバースリップで慎重に覆ってください。気泡を避けるため、カバースリップの片方の端をスライドの上に置き、隣接する端に沿ってメスを静かにスライドさせて、カバースリップをゆっくりと斜めに準備の上にドレープします。 ピペットを使用して、寒天パッドを囲む空間の3/4を水で満たします。空間の1/4を空気で残します。 カバースリップをワセリンで密封し、長時間の録音中に乾燥しないようにします。 細かいブラシを使用して、カバースリップの端の周りに溶けたワセリンの薄い層を伸ばします。注:これで録音の準備が整いました。 4. DICを調整し、4D顕微鏡記録を開始する スライドを顕微鏡ステージに置きます。低倍率対物レンズ(5倍または10倍)を使用して胚に焦点を合わせます。 100倍のイマージョン目標に変更します。 顕微鏡の光学部品を調整して、ノマルスキー画像を取得します。 コンデンサーに焦点を合わせます。 コンデンサーの絞りを完全に開き、フィールド絞りを閉じます(これにより、開口数が高くなり、分解能が向上します)。 顕微鏡上の両方の偏光子が、最大の光消光を引き起こすように配向していることを確認してください。 ウォラストンプリズムを回して、片側に照らされた胚の素敵な3次元画像を取得します。プリズムを反対方向に回して、反対側に胚を照らす効果を得ます。メモ: これらの手順は、分析対象の試料に微調整のみが必要なように、記録前に試験サンプルに対して実行できます。 顕微鏡で画像キャプチャを起動します。 5. 4Dムービーを分析します(図4)。 メモ: 記録が完了したら、細胞系譜トレースソフトウェアを使用して、細胞系譜を再構築および分析します。 細胞系譜トレースソフトウェアは、細胞培養物または組織断片における胚発生または動態の詳細な解析を実行するための強力なツールです。このプログラムは、細胞分裂、細胞周期長、遊走またはアポトーシス、およびその動態を含む、記録されたすべての細胞の完全な細胞系譜の生成を含む、サンプルの細胞ダイナミクスに関するいくつかのデータセットを抽出して定量化します。さらに、細胞分化は、細胞の形態学的変化または特定のマーカーの発現によってスコアリングすることができる。基本的に、ソフトウェア画面には2つのウィンドウが表示されます:左側のウィンドウでは、4Dムービーを前後に再生したり、トップレベルまたはボトムレベルまで上下に再生したりして、録画中に各セルを時間と空間で追跡することができます。右側の未亡人では、細胞系譜が生成されます。4Dムービーでセルの核をクリックすると、リネージュウィンドウにポイントが生成され、セル名、運命、空間座標の情報が表示されます。特定の細胞の細胞系譜は、4Dムービーを前方に再生し、核を定期的にクリックして、時間の経過とともにその特定の細胞の有糸分裂をマークすることによって生成されます。記録された細胞の各々についてこのプロセスを繰り返すと、胚または試料の完全な細胞系譜を生成する。各細胞の空間座標に関する保存された情報は、後で3D胚モデルおよび細胞遊走経路を再構築するために使用される。 リネージュトレースソフトウェアを開き、上部のバーメニューに移動して選択して新しいプロジェクトを作成します。ファイルの|新しいプロジェクト。 記録温度に応じて細胞系譜テンプレートを選択します:25°Cで記録するためのDB08、20°Cで記録するためのDB10、および15°Cで記録するためのDB12。 表示ウィンドウで記録パラメータを設定します:スキャン数(通常は1500)、スキャン間隔(30秒)、レベル数(30)、レベル間の距離(1ミクロン)。 画像ファイルと形式を選択します。 イメージが保存されたイメージディレクトリを選択します。 イメージを単一のイメージ (レベルと時間ごとに 1 つのイメージ) として保存するか、マルチイメージの Z スタックとして保存するかを選択します。 ファイル名とイメージ形式を決定します。通常、単一のイメージは次の名前で保存されます。X0000L00C1 (スキャン 0、レベル 0、チャネル 1 の場合)X0000L01C1 (スキャン 0、レベル 1、チャネル 1 の場合)X0000L02C1 (スキャン 0、レベル 2、チャネル 1 の場合)…X0001L00C1 (スキャン 1、レベル 0、チャネル 1 の場合)X0001L01C1 (スキャン 1、レベル 1、チャネル 1 の場合)…X0300L04C1 (スキャン 300、レベル 4、チャネル 1 の場合)…メモ: 画像を圧縮形式で保存すると、ハードディスクの空き容量を節約できます。 光チャンネルを定義します:DIC光学用に1つ、GFP用に2つ、RFP用に3つなど。4Dレコーディングで使用されたものを追加します。「チャネル処理が有効」をクリックして検出します。 胚の細胞系譜の追跡を開始する。画面には、ビデオウィンドウと細胞系譜ウィンドウの2つの主要なウィンドウが含まれるようになりました。 リネージュウィンドウで、リネージュ分岐を選択し、マウスを使用してビデオウィンドウ上のこのセルに対応するセル核をクリックします。 カーソルキーを使用して、4Dムービーを前後、またはレベルを上下に再生して、セルを空間的かつ時間経過とともに追跡します。 定期的に細胞核をクリックします。これにより、リネージュ分岐に点が生成され、この時点でのセルの空間座標が登録されます。その結果、細胞系譜が進行し、胚の3D再構成が可能となる。 リターンキーをクリックして有糸分裂をマークします。次に、娘セルの1つを選択し、以前と同じようにそれに従います。 残りの胚細胞についてこのプロセス(ステップ5.6.1~5.6.4)を繰り返して、完全な細胞系譜をトレースするか、アポトーシスを起こしている細胞などの関心のある特定の細胞を追跡します。 変異系譜をステレオタイプのWT C. elegans 細胞系譜と比較する。