4D المجهري: كشف Caenorhabditis elegans التطور الجنيني باستخدام المجهر نومارسكي
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لإعداد وتركيب أجنة Caenorhabditis elegans ، وتسجيل التطور تحت مجهر 4D وتتبع سلالة الخلايا.
Abstract
المجهر 4D هو أداة لا تقدر بثمن لكشف عملية النمو الجنيني في الحيوانات المختلفة. على مدى العقود الماضية ، برزت Caenorhabditis elegans كواحدة من أفضل النماذج لدراسة التنمية. من وجهة نظر بصرية ، فإن حجمها وجسمها الشفاف يجعلان هذه الديدان الخيطية عينة مثالية للفحص المجهري DIC (تباين التداخل التفاضلي أو Nomarski). توضح هذه المقالة بروتوكولا لزراعة الديدان الخيطية C. elegans ، وإعداد وتركيب أجنة ، وإجراء الفحص المجهري 4D وتتبع نسب الخلايا. تعتمد هذه الطريقة على سجلات الفاصل الزمني متعدد البؤر لصور Nomarski وتحليلها باستخدام برامج محددة. تكشف هذه التقنية عن ديناميكيات النمو الجنيني على المستوى الخلوي. يمكن اكتشاف أي عيب جنيني في الطفرات ، مثل مشاكل في اتجاه المغزل أو هجرة الخلايا أو موت الخلايا المبرمج أو مواصفات مصير الخلية ، وتسجيلها بكفاءة. تقريبا كل خلية واحدة من الجنين يمكن متابعتها حتى اللحظة التي يبدأ فيها الجنين في التحرك. إن تتبع السلالة الخلوية الكاملة لجنين C. elegans بواسطة المجهر 4D DIC أمر شاق ، لكن استخدام برامج محددة يسهل هذه المهمة إلى حد كبير. بالإضافة إلى ذلك ، هذه التقنية سهلة التنفيذ في المختبر. المجهر 4D هو أداة متعددة الاستخدامات ويفتح إمكانية إجراء تحليل لا مثيل له للتطور الجنيني.
Introduction
الفحص المجهري 4D هو نظام تسجيل متعدد البؤر بفاصل زمني يسمح للباحثين بتسجيل وقياس ديناميكيات الخلية للعينة البيولوجية مكانيا وبمرور الوقت. يمكن أن تخضع مزارع الخلايا أو الخمائر أو الأنسجة الحية لتحليل 4D ولكن هذه التقنية مناسبة بشكل خاص لتحليل تطور الأجنة الحية. تصل دقة هذا التحليل إلى مستوى كل خلية من خلايا الجنين. يمكن الكشف عن كل انقسام خلوي ، ويمكن تتبع حركات الخلايا بمرور الوقت. يتم تقييم مصائر الخلايا وفقا للموضع والشكل الذي تكتسبه الخلايا. يعزز استخدام بصريات نومارسكي تباين العينات الشفافة غير الملطخة باستخدام حزم ضوئية مستقطبة بشكل متعامد تتداخل في المستوى البؤري. تظهر الصور الناتجة ثلاثية الأبعاد ، مضاءة على جانب واحد.
تم تطوير طرق أخرى تعتمد على استخدام المجهر البؤري والحيوانات المعدلة وراثيا GFP للكشف التلقائي عن النوى وتوليد سلالات الخلايا 1,2. ميزة هذه الأنظمة واضحة: البرنامج يتجاوز إلى حد كبير الحاجة إلى وضع علامة يدويا على كل نواة على مدى فترة من الزمن (على الرغم من أن بعض الإشراف اليدوي مطلوب خلال المراحل المتأخرة). ومع ذلك ، فإن العمليات الخلوية التي تنطوي على تغييرات في شكل الخلية أو ديناميكيات الغشاء ، مثل تلك التي تحدث أثناء تمايز الخلايا أو الهجرة أو موت الخلايا المبرمج أو ابتلاع الجثة ، تظل مخفية كخلفية سوداء في صور النوى الموسومة بالفلورسنت.
في المقابل ، يظهر مجهر نومارسكي 4D (ويسمى أيضا مجهر DIC ، مجهر تباين التداخل التفاضلي) كلا من النوى وتغيرات شكل الخلية التي تحدث أثناء تطور النوع البري أو الحيوانات المتحولة. وهذا يسمح بتتبع نسب الخلايا باستخدام المجاهر القياسية، باستخدام الضوء المنقول فقط. ليست هناك حاجة عامة لاستخدام الحيوانات المعدلة وراثيا إلا لإظهار أنماط تعبير محددة ، وفي هذه الحالة يمكن أن تكون عمليات المسح الفلورية متداخلة. لذلك ، يمكن أن يكون هذا هو النهج الأمثل للعديد من المختبرات التي تعمل على عمليات الخلايا الديناميكية مثل تكوين الأجنة أو موت الخلايا المبرمج الذي يمكن تسليط الضوء عليه تحت المجهر DIC3،4،5،6،7.
تتوفر العديد من البرامج المرنة وسهلة الاستخدام لالتقاط الصور المجهرية وإعادة بناء سلالات الخلايا ونماذج 3D ومسارات هجرة الخلايا وما إلى ذلك في العينة المسجلة. في تجربة قياسية ، يتم الحصول على الصور في سلسلة من المستويات البؤرية ، على مسافة ثابتة ، يعتمد عددها على سمك العينة. يمكن تحسين الدقة الزمنية للتحليل عن طريق زيادة تردد المسح. لا يوجد أي حد تقريبا لمدة التسجيل بخلاف سعة تخزين الكمبيوتر. على سبيل المثال، بالنسبة لتحليل تطور جنين C. elegans ، نحصل بشكل روتيني على صور على 30 مستوى بؤري (1 ميكرون خطوة لكل منها)، كل 30 ثانية لمدة 12 ساعة.
تم تطبيق هذه الأنظمة على تحليل العديد من الأجنة الحيوانية مثل Caenorhabditis elegans 8,9,10 و Drosophila melanogaster11 و nematode embryosالأخرى 12,13 و tardigrades14,15 وحتى أجنة الفئران المبكرة 16. الشرط الوحيد هو وجود جنين شفاف قادر على التطور على إعداد الشريحة تحت المجهر.
باختصار ، يعد الفحص المجهري 4D القائم على DIC مفيدا بشكل خاص ل 1) تحليل التطور الجنيني للحيوانات الصغيرة والشفافة: تتبع سلالة الخلايا ، ومسارات هجرة الخلايا ، وتوليد نماذج 3D ، وما إلى ذلك ؛ 2) تحديد أنماط التعبير الجيني ؛ 3) دراسة ديناميكيات زراعة الخلايا ، من الخميرة إلى الخلايا البشرية ؛ 4) تحليل ديناميات الأنسجة أو شظايا الجنين ؛ 5) تحديد كمي لحركية موت الخلايا وابتلاع الجثث ؛ و 6) إجراء تحليل السلالات المقارن على أساس الخصائص التنموية الجنينية. إذا كان هناك اهتمام بأي من هذه الموضوعات (أو مواضيع مماثلة) ، يمكن استخدام المجهر 4D.
Protocol
Representative Results
Discussion
أحد التحديات الرئيسية في علم الأحياء الحديث هو فهم تطور الكائنات الحية متعددة الخلايا. برزت C. elegans كواحدة من أفضل النماذج المناسبة لدراسة التنسيق الدقيق بين تكاثر الخلايا وتمايز الخلايا في الجنين النامي. من وجهة نظر بصرية ، فإن جسمها الشفاف وحجمها الصغير يجعلان هذه الديدان الخيطية عينة مثالية للفحص المجهري DIC. كما خضعت كائنات حية أخرى ذات خصائص مماثلة لتحليل المجهر 4D11،12،13،14،15،16.
بالنسبة لتلك الدراسات التنموية، فإن تعطيل الجينات إما عن طريق علم الوراثة الأمامي أو العكسي يوفر دليلا على مشاركته في تكوين الأجنة. بمجرد أن يثبت أن الجين يلعب دورا في التنمية ، فإن الخطوة التالية هي تحديد دوره الدقيق في إنشاء خطة الجسم الصحيحة. التلطيخ المناعي هو النهج المختار لمعظم النماذج. توضح هذه التقنية المشاكل في تمايز الخلايا أو التعبير عن علامات محددة. ومع ذلك، فإن أحد القيود الرئيسية لهذا النهج هو أنه لا يوفر سوى رؤية ثابتة للتعبير عن علامة واحدة أو أكثر عند نقطة ثابتة في التطوير. لا يمكن الحصول على رؤية ديناميكية لهذه العلامات طوال فترة التطور إلا عن طريق تلطيخ الأجنة المختلفة في نقاط زمنية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن إعادة بناء سلالة الخلايا في مثل هذه العينات الثابتة.
الفحص المجهري 4D هو نهج تكميلي لدراسة التطور الجنيني. تكشف هذه التقنية عن ديناميكيات التطوير بدقة على مستوى الخلية. أي عيب في الجنين مثل مشاكل في اتجاه المغزل ، وهجرة الخلايا ، موت الخلايا المبرمج ، ومواصفات مصير الخلية ، وما إلى ذلك ، سيظهر في فيلم 4D يمكن تصوره إلى الأمام والخلف ، وتحديده كميا وتسجيله من قبل الباحث. باستخدام هذه التقنية ، يمكن متابعة كل خلية في الجنين تقريبا حتى اللحظة التي يبدأ فيها الجنين في التحرك. الأجنة المعرضة للمجهر 4D مع الضوء المرئي فقط والبصريات نومارسكي لا تتكبد أضرارا ضوئية. يمكن أيضا إجراء عمليات المسح الفلوري داخل التسجيل للكشف عن متى وأين يتم التعبير عن الجين. يتم تحديد الأجنة التي تعاني من تلف ضوئي كبير من خلال تمديد دورة الخلية التي تسبب تشعيع قوي للأشعة فوق البنفسجية مقارنة بجنين سلالة WT القياسي. في هذه الحالة ، يمكن تقليل الضرر الضوئي عن طريق خفض شدة مصباح الأشعة فوق البنفسجية وزيادة حساسية الكاميرا أو وقت التعرض. يمكن أن تساعد الخصائص المورفولوجية والواسمات الجزيئية في توضيح التطور الجنيني لأي متحور.
من السهل تنفيذ نظام الفحص المجهري 4D في المختبر ، وبعد بعض الممارسة ، يتيح تحليلا لا مثيل له لديناميكيات الخلية وتتبع سلالات مزارع الخلايا والعينات الحية الشفافة على مستوى دقة كل خلية في مجال المجهر. لا يزال تتبع نسب الخلايا على صور DIC تتم معالجته يدويا. يستغرق الأمر وقتا طويلا ، وعلى الرغم من أن البرنامج يكتشف أخطاء النسب مثل فروع النسب المختلفة التي تميز نفس الخلية ، إلا أن الأخطاء ممكنة. في حين أن الكشف التلقائي عن الخلايا التي تحمل علامة GFP متطور بشكل جيد2 ، فإن برنامج تتبع السلالات التكميلي القائم على الخلايا غير المميزة وصور الضوء المرئي لا يزال في المرحلة المبكرة وغير مفيد حقا لتحليل الجنين الكامل. مما لا شك فيه أن تطبيق أنظمة التعرف على الصور في مجال الفحص المجهري للضوء المرئي سيحقق تقدما كبيرا في هذا المجال.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن ينوه بالدعم المقدم من مؤسسة ريوخا سالود (Fondos FEDER) ووزارة العلوم الإسبانية ، Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). يتم تمويل كريستينا روميرو أراندا من خلال زمالة من AECC (الرابطة الإسبانية كونترا إل كانسر).
Materials
| Caenorhabditis elegans (N2) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | N2 | WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis elegans (VZ454) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | VZ454 | gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Cell Lineage Tracing software | SIMI | Simi BioCell | This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html |
| Microscope camera | Hamamatsu | Orca-R2 | Miscroscope camera for both transmitted and UV light |
| Microscope control software | Caenotec | Time to Live | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 Börßum, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de |
| Microscope control software | Micro-manager | Micro-manager | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/ |
| Motorized microscope | Leica | Leica DM6000 | Motorized upright microscope to perform 4D microscopy |
| Standard equipment in a Molecular Biology lab. | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZ16FA | Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos. |
References
- Hardin, J. Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).
- Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).
- Nieto, C., et al. ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans. Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).
- Cabello, J., et al. PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans. Cell Death & Disease. 5, 1120 (2014).
- Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).
- Sáenz-Narciso, B., Gómez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated. Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).
- Zheleva, A. Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development. PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).
- Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software. Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).
- Boyd, L., Hajjar, C., O’Connell, K. Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).
- Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila. Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).
- Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata). Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).
- Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina. Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).
- Hejnol, A., Schnabel, R. The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations. Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).
- Hejnol, A., Schnabel, R. What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development. Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).
- Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions. Development. 135 (5), 953-962 (2008).
- Mora-Lorca, J. A. Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development. Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).
