4D-Mikroskopie: Entschlüsselung der Caenorhabditis elegans Embryonalentwicklung mittels Nomarski-Mikroskopie
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Befestigung von Caenorhabditis elegans-Embryonen , zur Aufzeichnung der Entwicklung unter einem 4D-Mikroskop und zur Verfolgung der Zelllinie vor.
Abstract
Die 4D-Mikroskopie ist ein unschätzbares Werkzeug zur Entschlüsselung des embryonalen Entwicklungsprozesses bei verschiedenen Tieren. In den letzten Jahrzehnten hat sich Caenorhabditis elegans zu einem der besten Modelle für das Studium der Entwicklung entwickelt. Aus optischer Sicht machen seine Größe und sein transparenter Körper diesen Fadenwurm zu einem idealen Exemplar für die DIC-Mikroskopie (Differential Interference Contrast oder Nomarski). Dieser Artikel veranschaulicht ein Protokoll für die Züchtung von C. elegans-Nematoden, die Vorbereitung und Montage ihrer Embryonen, die Durchführung von 4D-Mikroskopie und die Verfolgung von Zelllinien . Die Methode basiert auf multifokalen Zeitrafferaufzeichnungen von Nomarski-Bildern und Analysen mit spezifischer Software. Diese Technik zeigt die embryonale Entwicklungsdynamik auf zellulärer Ebene. Jeder embryonale Defekt bei Mutanten, wie Probleme in der Spindelorientierung, Zellmigration, Apoptose oder Zellschicksalsspezifikation, kann effizient erkannt und bewertet werden. Praktisch jede einzelne Zelle des Embryos kann bis zu dem Moment verfolgt werden, in dem sich der Embryo zu bewegen beginnt. Die Verfolgung der vollständigen Zelllinie eines C. elegans-Embryos durch 4D-DIC-Mikroskopie ist mühsam, aber die Verwendung spezifischer Software erleichtert diese Aufgabe erheblich. Darüber hinaus ist diese Technik im Labor einfach zu implementieren. Die 4D-Mikroskopie ist ein vielseitiges Werkzeug und eröffnet die Möglichkeit, eine beispiellose Analyse der Embryonalentwicklung durchzuführen.
Introduction
Die 4D-Mikroskopie ist ein multifokales Zeitraffer-Aufzeichnungssystem, mit dem Forscher die Zelldynamik einer biologischen Probe sowohl räumlich als auch im Zeitverlauf registrieren und quantifizieren können. Zellkulturen, Hefen oder lebendes Gewebe können einer 4D-Analyse unterzogen werden, aber diese Technik eignet sich besonders für die Analyse der Entwicklung lebender Embryonen. Die Auflösung dieser Analyse erreicht das Niveau jeder einzelnen Zelle des Embryos. Jede Zellteilung kann nachgewiesen werden, und Zellbewegungen können im Laufe der Zeit verfolgt werden. Zellschicksale werden nach der Position und Form bewertet, die Zellen einnehmen. Die Verwendung von Nomarski-Optiken verstärkt den Kontrast von unbefleckten transparenten Proben durch orthogonal polarisierte Lichtstrahlen, die in der Fokusebene interferieren. Die resultierenden Bilder erscheinen dreidimensional, auf einer Seite beleuchtet.
Andere Methoden, die auf der Verwendung von konfokaler Mikroskopie und transgenen GFP-Tieren zum automatischen Nachweis von Kernen und zur Erzeugung von Zelllinien basieren, wurden entwickelt 1,2. Der Vorteil dieser Systeme liegt auf der Hand: Die Software überschreibt die Notwendigkeit, jeden Kern über einen bestimmten Zeitraum manuell zu markieren (obwohl in den späten Phasen eine gewisse manuelle Überwachung erforderlich ist). Zelluläre Prozesse mit Veränderungen der Zellform oder Membrandynamik, wie sie bei Zelldifferenzierung, Migration, Apoptose oder Leichenverschlingung auftreten, bleiben jedoch als schwarzer Hintergrund in den fluoreszierend markierten Kernbildern verborgen.
Im Gegensatz dazu zeigt die 4D-Nomarski-Mikroskopie (auch DIC-Mikroskopie genannt, Differentielle Interferenzkontrastmikroskopie) sowohl Kern- als auch Zellformänderungen, die während der Entwicklung von Wildtyp- oder Mutantentieren auftreten. Dies ermöglicht die Verfolgung von Zelllinien mit Standardmikroskopen, bei denen nur Durchlicht verwendet wird. Es besteht keine allgemeine Notwendigkeit, transgene Tiere zu verwenden, außer um spezifische Expressionsmuster zu zeigen, in diesem Fall können fluoreszierende Scans interkaliert werden. Daher könnte dies der optimale Ansatz für viele Labore sein, die an dynamischen Zellprozessen wie Embryogenese oder Apoptose arbeiten, die unter DIC-Mikroskopie 3,4,5,6,7 hervorgehoben werden können.
Für die Aufnahme mikroskopischer Bilder und die Rekonstruktion von Zelllinien, 3D-Modellen, Zellmigrationspfaden usw. in der aufgezeichneten Probe stehen mehrere flexible und benutzerfreundliche Programme zur Verfügung. In einem Standardexperiment werden Bilder in einer Reihe von Fokusebenen in einem konstanten Abstand aufgenommen, deren Anzahl von der Probendicke abhängt. Die zeitliche Auflösung der Analyse kann durch Erhöhung der Scanfrequenz optimiert werden. Es gibt praktisch keine andere Begrenzung für die Dauer der Aufzeichnung als die Computerspeicherkapazität. Zum Beispiel erfassen wir für eine C. elegans-Embryoentwicklungsanalyse routinemäßig Bilder auf 30 Fokusebenen (jeweils 1 Mikrometer-Schritt), alle 30 Sekunden für 12 Stunden.
Diese Systeme wurden auf die Analyse mehrerer tierischer Embryonen wie Caenorhabditis elegans8,9,10, Drosophila melanogaster11, anderer Nematodenembryonen12,13, Bärtierchen 14,15 und sogar früher Mausembryonen 16 angewendet. Die einzige Voraussetzung ist, einen transparenten Embryo zu haben, der sich auf dem Objektträger unter dem Mikroskop entwickeln kann.
Zusammenfassend ist die DIC-basierte 4D-Mikroskopie besonders nützlich für 1) die Analyse der Embryonalentwicklung von kleinen, transparenten Tieren: Verfolgung der Zelllinie, Zellmigrationspfade, Erstellung von 3D-Modellen usw.; 2) Definition von Genexpressionsmustern; 3) Untersuchung der Zellkulturdynamik, von Hefe bis zu menschlichen Zellen; 4) Analyse der Gewebedynamik oder der Embryonenfragmente; 5) Quantifizierung der Zelltodkinetik und des Leichenverschlings; und 6) Durchführung einer vergleichenden Phylogenieanalyse auf der Grundlage der embryonalen Entwicklungsmerkmale. Wenn Interesse an einem dieser Themen (oder ähnlichen) besteht, kann die 4D-Mikroskopie verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine der größten Herausforderungen in der modernen Biologie ist das Verständnis der Entwicklung vielzelliger Organismen. C. elegans hat sich als eines der am besten geeigneten Modelle für die Untersuchung der feinen Koordination zwischen Zellproliferation und Zelldifferenzierung im sich entwickelnden Embryo herausgestellt. Aus optischer Sicht machen sein transparenter Körper und seine geringe Größe diesen Fadenwurm zu einem idealen Exemplar für die DIC-Mikroskopie. Andere Organismen mit ähnlichen Eigenschaften wurden ebenfalls einer 4D-Mikroskopie-Analyseunterzogen 11,12,13,14,15,16.
Für diese Entwicklungsstudien liefert die Geninaktivierung durch Vorwärts- oder Rückwärtsgenetik einen Hinweis auf ihre Beteiligung an der Embryogenese. Sobald nachgewiesen wurde, dass ein Gen eine Rolle bei der Entwicklung spielt, besteht der nächste Schritt darin, seine genaue Rolle bei der Festlegung des richtigen Körperplans zu definieren. Die Immunfärbung ist der gewählte Ansatz für die meisten Modelle. Diese Technik klärt Probleme bei der Zelldifferenzierung oder Expression spezifischer Marker auf. Eine wesentliche Einschränkung dieses Ansatzes besteht jedoch darin, dass er nur eine statische Ansicht des Ausdrucks eines einzelnen oder mehrerer Marker an einem festen Punkt in der Entwicklung bietet. Eine dynamische Sicht auf diese Marker während der gesamten Entwicklung kann nur durch die Färbung verschiedener Embryonen zu unterschiedlichen Zeitpunkten erhalten werden. Zudem ist eine Zelllinienrekonstruktion in solchen fixierten Proben nicht möglich.
Die 4D-Mikroskopie ist ein komplementärer Ansatz zur Untersuchung der Embryonalentwicklung. Diese Technik zeigt die Entwicklungsdynamik bei einer Auflösung auf Zellebene. Jeder Defekt im Embryo wie Probleme in der Spindelorientierung, Zellmigration, Apoptose, Zellschicksalsspezifikation usw. werden in einem 4D-Film angezeigt, der vom Forscher vorwärts und rückwärts visualisiert, quantifiziert und bewertet werden kann. Mit dieser Technik kann praktisch jede einzelne Zelle im Embryo bis zu dem Moment verfolgt werden, in dem sich der Embryo zu bewegen beginnt. Embryonen, die einer 4D-Mikroskopie mit nur sichtbarem Licht und Nomarski-Optik unterzogen werden, erleiden keine Lichtschäden. Fluoreszierende Scans können auch innerhalb der Aufzeichnung interkaliert werden, um zu erkennen, wann und wo ein Gen exprimiert wird. Embryonen, die erhebliche Lichtschäden erleiden, werden durch die Verlängerung des Zellzyklus identifiziert, die im Vergleich zu einem Standard-WT-Linienembryo starke UV-Bestrahlung verursacht. In diesem Fall können Lichtschäden reduziert werden, indem die Intensität der UV-Lampe verringert und die Kameraempfindlichkeit oder die Belichtungszeit erhöht werden. Morphologische Merkmale und molekulare Marker können helfen, die embryonale Entwicklung einer Mutante zu klären.
Die Einrichtung eines 4D-Mikroskopiesystems ist im Labor einfach zu implementieren und ermöglicht nach einiger Übung eine unübertroffene Analyse der Zelldynamik und Linienverfolgung von Zellkulturen und lebenden transparenten Proben auf einer Auflösungsebene jeder einzelnen Zelle im Mikroskopfeld. Die Zelllinienverfolgung auf DIC-Bildern wird immer noch von Hand verarbeitet. Es ist zeitaufwendig und obwohl die Software Abstammungsfehler erkennt, wie z.B. verschiedene Abstammungszweige, die dieselbe Zelle markieren, sind Fehler möglich. Während die automatische Erkennung von GFP-markierten Zellen gut entwickelt ist2, befindet sich die ergänzende Linienverfolgungssoftware, die auf unmarkierten Zellen und Bildern des sichtbaren Lichts basiert, noch im Frühstadium und ist für eine vollständige Embryonenanalyse nicht wirklich nützlich. Ohne Zweifel wird die Anwendung von Bilderkennungssystemen auf dem Gebiet der Mikroskopie des sichtbaren Lichts einen großen Fortschritt auf diesem Gebiet bringen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Rioja Salud Foundation (Fondos FEDER) und dem spanischen Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda wird durch ein Stipendium der AECC (Asociación Española Contra el Cáncer) finanziert.
Materials
| Caenorhabditis elegans (N2) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | N2 | WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis elegans (VZ454) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | VZ454 | gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Cell Lineage Tracing software | SIMI | Simi BioCell | This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html |
| Microscope camera | Hamamatsu | Orca-R2 | Miscroscope camera for both transmitted and UV light |
| Microscope control software | Caenotec | Time to Live | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 Börßum, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de |
| Microscope control software | Micro-manager | Micro-manager | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/ |
| Motorized microscope | Leica | Leica DM6000 | Motorized upright microscope to perform 4D microscopy |
| Standard equipment in a Molecular Biology lab. | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZ16FA | Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos. |
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