Detección de variantes genéticas en el gen CALR mediante análisis de fusión de alta resolución

Las variantes genéticas somáticas en el gen de la calreticulina(CALR)fueron reconocidas en 2013 en pacientes con neoplasias mieloproliferativas (MPN) como trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria^1,2. Desde entonces, se han descubierto más de 50 variantes genéticas en el gen CALR, induciendo un desplazamiento de marco +1 (−1+2)³. Las dos variantes genéticas CALR más frecuentes son una deleción de 52 pb (NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), también llamada mutación tipo 1, y una inserción de 5 pb (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), también llamada mutación tipo 2. Estas dos variantes genéticas representan el 80% de todas las variantes genéticas de CALR. Los otros se han clasificado como tipo 1 o tipo 2 utilizando algoritmos basados en la preservación de una hélice α cercana al tipo salvaje CALR^4. Aquí, presentamos uno de los métodos altamente sensibles y rápidos para la detección de variantes genéticas CALR, el método de análisis de fusión de alta resolución (HRM). Este método permite la detección rápida de variantes genéticas tipo 1 y tipo 2, que representan la mayoría de las mutaciones CALR ⁵. HrM se introdujo en combinación con la »reacción en cadena de la polimerasa« en tiempo real (qPCR) en 1997 como una herramienta para detectar la mutación en el factor V Leiden^6. En comparación con la secuenciación de Sanger que representa la técnica estándar de oro, la HRM es un método más sensible y menos específico⁵. El método HRM es un buen método de cribado que permite un análisis rápido de un gran número de muestras con un gran coste-beneficio⁵. Es un método de PCR simple realizado en presencia de un tinte fluorescente y no requiere habilidades específicas. Otro beneficio es que el procedimiento en sí no daña ni destruye la muestra analizada que nos permite reutilizar la muestra para electroforesis o secuenciación de Sanger después del procedimiento HRM⁷. La única desventaja es que a veces es difícil interpretar los resultados. Además, la HRM no detecta la mutación exacta en pacientes con mutaciones no tipo 1 o tipo 2^8. En estos pacientes, se debe realizar la secuenciación de Sanger (Figura 1).

La HRM se basa en la amplificación de la región específica del ADN en presencia de un colorante fluorescente de ADN saturado, que se incorpora en el ADN de doble cadena (dsDNA). El colorante fluorescente emite luz cuando se incorpora en el dsDNA. Después de un aumento progresivo de la temperatura, el dsDNA se descompone en ADN monocatenario, que se puede detectar en la curva de fusión como una disminución repentina en la intensidad de la fluorescencia. La forma de la curva de fusión depende de la secuencia de ADN que se utiliza para detectar la mutación. Las curvas de fusión de las muestras se comparan con las curvas de fusión de mutaciones conocidas o CALR de tipo salvaje. Las curvas de fusión distintas representan una mutación diferente que no es tipo 1 o tipo 2^9.

El algoritmo para la detección de variantes genéticas somáticas en el gen CALR mediante HRM, electroforesis en gel de agarosa y método de secuenciación(Figura 1)fue utilizado y validado en el estudio retrospectivo publicado antes^{del 10.}