Обнаружение генетических вариантов в гене CALR с использованием анализа плавления с высоким разрешением
Summary
Анализ плавления с высоким разрешением (HRM) является чувствительным и быстрым решением для обнаружения генетических вариантов. Это зависит от различий последовательностей, которые приводят к тому, что гетеродуплексы изменяют форму кривой плавления. Путем расчесывания HRM и электрофореза агарозного геля можно идентифицировать различные типы генетических вариантов, таких как индели.
Abstract
Анализ плавления с высоким разрешением (HRM) является мощным методом генотипирования и сканирования генетических вариаций. Большинство применений HRM зависят от насыщения красителей ДНК, которые обнаруживают различия последовательностей, и гетеродуплексов, которые изменяют форму кривой плавления. Отличное разрешение прибора и специальное программное обеспечение для анализа данных необходимы для выявления небольших различий кривой плавления, которые идентифицируют вариант или генотип. Различные типы генетических вариантов с различными частотами могут наблюдаться в гене, специфичном для пациентов с конкретным заболеванием, особенно раком, и в гене CALR у пациентов с филадельфийскими хромосомно-отрицательными миелопролиферативными новообразованиями. Однонуклеотидные изменения, вставки и/или делеции (indels) в интересующем гене могут быть обнаружены с помощью анализа HRM. Идентификация различных типов генетических вариантов в основном основана на контроле, используемом в анализе qPCR HRM. Однако по мере увеличения длины продукта разница между кривыми дикого типа и гетерозигот становится меньше, а тип генетического варианта определить сложнее. Поэтому, где индели являются преобладающим генетическим вариантом, ожидаемым в интересующем гене, для уточнения результата HRM может быть использован дополнительный метод, такой как электрофорез агарозного геля. В некоторых случаях неубедительный результат должен быть повторно проверен / повторно диагностирован стандартным секвенированием Сэнгера. В этом ретроспективном исследовании мы применили метод к JAK2 V617F-отрицательным пациентам с MPN.
Introduction
Соматические генетические варианты в гене калретикулина(CALR)были признаны в 2013 году у пациентов с миелопролиферативными новообразованиями (MPN), такими как эссенциальная тромбоцитемия и первичный миелофиброз1,2. С тех пор было обнаружено более 50 генетических вариантов в гене CALR, индуцирующих сдвиг кадра +1 (−1+2)3. Двумя наиболее частыми генетическими вариантами CALR являются делеция 52 bp (NM_004343,3 (CALR): c.1099_1150del52, p. (Leu367Thrfs * 46)), также называемая мутацией типа 1, и вставка 5 bp (NM_004343,3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p. (Lys385Asnfs * 47)), также называемая мутацией типа 2. Эти два генетических варианта составляют 80% всех генетических вариантов CALR. Другие были классифицированы как тип 1-подобный или тип 2-подобный с использованием алгоритмов, основанных на сохранении α спирали, близкой к дикому типу CALR4. Здесь мы представляем один из высокочувствительных и быстрых методов обнаружения генетических вариантов CALR, метод анализа плавления с высоким разрешением (HRM). Этот метод позволяет быстро обнаружить генетические варианты типа 1 и типа 2, которые представляют собой большинство мутаций CALR 5. HRM был введен в сочетании с «полимеразной цепной реакцией» в реальном времени (qPCR) в 1997 году как инструмент для обнаружения мутации в факторе V Лейдена6. По сравнению с секвенированием Сэнгера, которое представляет собой технику золотого стандарта, HRM является более чувствительным и менее специфическим методом5. Метод HRM является хорошим методом скрининга, который позволяет проводить быстрый анализ большого количества образцов с большой экономической выгодой5. Это простой метод ПЦР, выполняемый в присутствии флуоресцентного красителя и не требующий специфических навыков. Еще одно преимущество заключается в том, что сама процедура не повреждает и не разрушает анализируемый образец, что позволяет нам повторно использовать образец для электрофореза или секвенирования Сэнгера после процедуры HRM7. Единственным недостатком является то, что иногда трудно интерпретировать результаты. Кроме того, HRM не обнаруживает точную мутацию у пациентов с мутациями не типа 1 или типа 28. У этих пациентов следует выполнять секвенирование Сэнгера(рисунок 1).
HRM основан на амплификации специфической области ДНК в присутствии насыщенного ДНК флуоресцентного красителя, который включен в двухцепочечную ДНК (dsDNA). Флуоресцентный краситель излучает свет при включении в дцДНК. После прогрессивного повышения температуры дцДНК распадается на одноцепочечную ДНК, которая может быть обнаружена на кривой плавления как внезапное снижение интенсивности флуоресценции. Форма кривой плавления зависит от последовательности ДНК, которая используется для обнаружения мутации. Кривые плавления образцов сравниваются с кривыми плавления известных мутаций или CALR дикого типа. Отчетливые кривые плавления представляют собой другую мутацию, которая не относится к типу 1 илитипу 2 9.
Алгоритм обнаружения соматических генетических вариантов в гене CALR методом HRM, электрофореза агарозного геля и секвенирования(Рисунок 1)был использован и валидирован в ретроспективном исследовании, опубликованном до10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Расплавление ДНК с высоким разрешением является простым решением для генотипирования и сканирования генетических вариантов14. Это зависит от различий последовательностей, которые приводят к гетеродуплексам, которые изменяют форму кривой плавления. Различные типы генети…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить всех академических экспертов и сотрудников специализированной гематологической лаборатории, отделения гематологии, отделения внутренней медицины, Университетского медицинского центра Любляны.
Materials
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
References
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) – More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. . QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. . High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. . High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D. Agarose Gel Electrophoresis. Current Protocols in Immunology. 2, (1992).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
