Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi Kullanarak CALR Geninde Genetik Varyant Tespiti
Summary
Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRM), genetik varyant tespiti için hassas ve hızlı bir çözümdür. Erime eğrisinin şeklini değiştiren heteroduplexes ile sonuçlanan sıra farklılıklarına bağlıdır. HRM ve agarose jel elektroforezi taranarak, indels gibi farklı genetik varyantlar tanımlanabilir.
Abstract
Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRM), genotipleme ve genetik varyasyon taraması için güçlü bir yöntemdir. Çoğu HRM uygulaması, dizi farklılıklarını algılayan DNA boyalarını ve erime eğrisinin şeklini değiştiren heteroduplexleri doyurma işlemine bağlıdır. Bir varyantı veya genotipi tanımlayan küçük erime eğrisi farklılıklarını tanımlamak için mükemmel cihaz çözünürlüğü ve özel veri analizi yazılımı gereklidir. Philadelphia kromozomu-negatif miyeloproliferatif neoplazmları olan hastalarda, kanser başta olmak üzere belirli bir hastalığı olan hastalara özgü gende ve CALR geninde farklı frekanslara sahip farklı genetik varyantlar gözlenebilir. İlgi geninde tek nükleotid değişiklikleri, eklemeler ve/veya silmeler (indels) HRM analizi ile tespit edilebilir. Farklı genetik varyant türlerinin tanımlanması çoğunlukla qPCR HRM testinde kullanılan kontrollere dayanmaktadır. Bununla birlikte, ürün uzunluğu arttıkça, vahşi tip ve heterozygot eğrileri arasındaki fark küçülür ve genetik varyant türünü belirlemek daha zordur. Bu nedenle, indellerin ilgi geninde beklenen yaygın genetik varyant olduğu durumlarda, HRM sonucunun netleşmesi için agarose jel elektroforezi gibi ek bir yöntem kullanılabilir. Bazı durumlarda, sonuçsuz bir sonuç standart Sanger dizilimi tarafından yeniden denetlenmeli/yeniden teşhis edilmelidir. Bu retrospektif çalışmada yöntemi MPN’li JAK2 V617F negatif hastalara uyguladık.
Introduction
Kalretikülin geninde(CALR)somatik genetik varyantlar 2013 yılında esansiyel trombositemi ve primer miyelofibrozis1,2gibi miyeloproliferatif neoplazmları (MPN) olan hastalarda tanınmıştır. O zamandan beri, CALR geninde 50’den fazla genetik varyant keşfedildi ve bu da +1 (−1+2) çerçeve3’üindükledi. En sık görülen iki CALR genetik varyantı 52 bp silmedir (NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), tip 1 mutasyonu ve 5 bp ekleme (NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), tip 2 mutasyonu olarak da adlandırılır. Bu iki genetik varyant tüm CALR genetik varyantlarının %80’ini temsil eder. Diğerleri, vahşi tip CALR4’eyakın bir α sarmalının korunmasına dayanan algoritmalar kullanılarak tip 1 gibi veya tip 2 gibi sınıflandırılmıştır. Burada, CALR genetik varyant tespiti için son derece hassas ve hızlı yöntemlerden biri olan yüksek çözünürlüklü erime analiz yöntemini (HRM) sunuyoruz. Bu yöntem, CALR mutasyonlarının çoğunluğunu temsil eden tip 1 ve tip 2 genetik varyantların hızlı bir şekilde algılanmasını sağlar5. HRM, 1997 yılında V Leiden6faktöründeki mutasyonu tespit etmek için bir araç olarak gerçek zamanlı »polimeraz zincir reaksiyonu« (qPCR) ile birlikte tanıtıldı. Altın standart tekniği temsil eden Sanger dizilimine kıyasla, HRM daha hassas ve daha az spesifik bir yöntemdir5. HRM yöntemi, çok sayıda numunenin hızlı bir şekilde analizini sağlayan iyi birtarama yöntemidir. Floresan boya varlığında gerçekleştirilen basit bir PCR yöntemidir ve belirli beceriler gerektirmez. Başka bir fayda, prosedürün kendisinin, numuneyi HRM prosedüründen sonra elektroforezi veya Sanger dizilemesi için yeniden kullanmamızı sağlayan analiz edilen örneğe zarar vermemesi veya yoketmemesidir 7. Tek dezavantajı, bazen sonuçları yorumlamanın zor olmasıdır. Ek olarak, HRM tip 1 veya tip 2 mutasyonu olmayan hastalarda tam mutasyonu tespit etmez8. Bu hastalarda Sanger dizilimi yapılmalıdır(Şekil 1).
HRM, çift iplikli DNA’ya (dsDNA) dahil edilen doygun DNA floresan boyası varlığında spesifik DNA bölgesinin amplifikasyonuna dayanmaktadır. Floresan boya, dsDNA’ya dahil edildiğinde ışık yayar. Sıcaklıkta ilerleyici bir artış sonrasında dsDNA, erime eğrisinde floresan yoğunluğunda ani bir azalma olarak tespit edilebilen tek iplikli DNA’ya ayrılır. Erime eğrisinin şekli mutasyonu tespit etmek için kullanılan DNA dizisine bağlıdır. Örneklerin erime eğrileri, bilinen mutasyonların veya vahşi tip CALR’nin erime eğrileriyle karşılaştırılır. Farklı erime eğrileri tip 1 veya tip 2 9 olmayan farklı bir mutasyonu temsileder.
10’danönce yayınlanan retrospektif çalışmada HRM, agarose jel elektroforezi vedizileme yöntemi ile CALR geninde somatik genetik varyant tespiti algoritması kullanılmıştır ve doğrulanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA’nın yüksek çözünürlüklü erimesi genotipleme ve genetik varyant taraması için basit bir çözümdür14. Erime eğrisinin şeklini değiştiren heteroduplexes ile sonuçlanan sıra farklılıklarına bağlıdır. Kanserli belirli bir grup hastaya özgü gende çeşitli frekanslara sahip farklı genetik varyantlar gözlenebilir 1,2,15,16,<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Ljubljana Üniversitesi Tıp Merkezi, İhtisas Hematoloji Laboratuvarı, Hematoloji Bölümü, İç Hastalıkları Anabilim Dalı’ndaki tüm akademik uzmanlara ve çalışanlara teşekkür eder.
Materials
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
References
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) – More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. . QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. . High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. . High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D. Agarose Gel Electrophoresis. Current Protocols in Immunology. 2, (1992).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
