זיהוי וריאנטים גנטיים בגן CALR באמצעות ניתוח התכה ברזולוציה גבוהה
Summary
ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה (HRM) הוא פתרון רגיש ומהיר לגילוי וריאנטים גנטיים. זה תלוי בהבדלי רצף שגורמים להטרודלקסים לשנות את צורת עקומת ההיתוך. על ידי סירוק אלקטרופורזה HRM וג’ל אגרוז, ניתן לזהות סוגים שונים של וריאנטים גנטיים כגון indels.
Abstract
ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה (HRM) הוא שיטה רבת עוצמה לגנוטיפינג וסריקה גנטית. רוב יישומי HRM תלויים בצבעי דנ”א רוויים המזהים הבדלי רצף, והטרודלקסים שמשנים את צורת עקומת ההיתוך. רזולוציית מכשיר מעולה ותוכנה לניתוח נתונים מיוחדים נדרשים כדי לזהות את ההבדלים הקטנים בעקומה נמסה המזהים גרסה או גנוטיפ. סוגים שונים של וריאנטים גנטיים עם תדרים מגוונים ניתן לראות בגן ספציפי עבור חולים עם מחלה ספציפית, במיוחד סרטן בגן CALR בחולים עם כרומוזום פילדלפיה שלילי neoplasms מיאלופרופרטיבי. ניתן לזהות שינויים נוקלאוטידים בודדים, הוספות ו/או מחיקות (indels) בגן העניין על-ידי ניתוח HRM. הזיהוי של סוגים שונים של וריאנטים גנטיים מבוסס בעיקר על הפקדים המשמשים לבדיקת QPCR HRM. עם זאת, ככל שאורך המוצר גדל, ההבדל בין עקומות מסוג בר והטרוזיגוטה הופך לקטן יותר, וסוג הגרסה הגנטית קשה יותר לקבוע. לכן, כאשר indels הם הגרסה הגנטית הנפוצה הצפויה בגן העניין, שיטה נוספת כגון אלקטרופורזה ג’ל אגרוז יכול לשמש להבהרת התוצאה HRM. במקרים מסוימים, יש לבדוק מחדש/לאבחן מחדש תוצאה חד משמעית על-ידי רצף סנגר רגיל. במחקר רטרוספקטיבי זה, יישמנו את השיטה על JAK2 V617F-שלילי חולים עם MPN.
Introduction
וריאנטים גנטיים סומטיים בגן calreticulin (CALR) הוכרו בשנת 2013 בחולים עם ניופלסטים מיאלופריפירפיים (MPN) כגון תרומבוציטמיה חיונית ומיאלופיברוזיס ראשוני1,2. מאז, יותר מ -50 וריאנטים גנטיים בגן CALR התגלו, גרימת +1 (−1+2) frameshift3. שתי הווריאנטים הגנטיים הנפוצים ביותר של CALR הם מחיקה של 52 bp (NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52, עמ’ (Leu367Thrfs*46)), הנקראת גם מוטציה מסוג 1, והכנסת 5 bp (NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), הנקראת גם מוטציה מסוג 2. שתי וריאנטים גנטיים אלה מייצגים 80% מכל הווריאנטים הגנטיים של CALR. האחרים סווגו כסוג 1 או סוג 2 – כמו שימוש באלגוריתמים המבוססים על שימור של α סליל קרוב לסוג פראי CALR4. כאן, אנו מציגים את אחת השיטות הרגישות והמהירות ביותר לגילוי וריאנטים גנטיים של CALR, שיטת ניתוח ההיתוך ברזולוציה גבוהה (HRM). שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר של וריאנטים גנטיים מסוג 1 וסוג 2, המייצגים את רוב מוטציות CALR 5. HRM הוצג בשילוב עם זמן אמת »תגובת שרשרת פולימראז« (qPCR) בשנת 1997 ככלי לזיהוי המוטציה בגורם V Leiden6. בהשוואה לרצף סנגר המייצג את הטכניקה הסטנדרטית המוזהבת, HRM היא שיטה רגישה יותר ופחות ספציפית5. שיטת HRM היא שיטת סינון טובה המאפשרת ניתוח מהיר של מספר רב של דגימות עם עלות-תועלת גדולה5. זוהי שיטת PCR פשוטה המבוצעת בנוכחות צבע פלואורסצנטי ואינה דורשת מיומנויות ספציפיות. יתרון נוסף הוא כי ההליך עצמו אינו פוגע או להרוס את המדגם המנותח המאפשר לנו לעשות שימוש חוזר במדגם עבור אלקטרופורזה או רצף סנגר לאחר הליך HRM7. החיסרון היחיד הוא שלפעמים קשה לפרש את התוצאות. בנוסף, HRM אינו מזהה את המוטציה המדויקת בחולים עם מוטציות שאינן מסוג 1 או סוג 28. בחולים אלה, יש לבצע רצף סנגר(איור 1).
HRM מבוסס על הגברה של אזור ה- DNA הספציפי בנוכחות צבע פלואורסצנטי DNA רווי, המשולב ב- DNA כפול גדילים (dsDNA). הצבע הפלואורסצנטי פולט אור כאשר הוא משולב ב- dsDNA. לאחר עלייה הדרגתית בטמפרטורה, dsDNA מתפרק לדנ”א נטוש יחיד, אשר ניתן לזהות על עקומת ההיתוך כירידה פתאומית בעוצמת הפלואורסצנטיות. צורת עקומת ההיתוך תלויה ברצף הדנ”א המשמש לזיהוי המוטציה. עקומות נמסות של דגימות מושוות לעקומות נמסות של מוטציות ידועות או CALR מסוג פראי. עקומות התכה נפרדות מייצגות מוטציה שונה שאינה מסוג 1 או סוג 29.
האלגוריתם לזיהוי וריאנטים גנטיים סומטיים בגן CALR על ידי HRM, אלקטרופורזה ג’ל אגרוז ושיטת רצף (איור 1) שימש ואומת במחקר רטרוספקטיבי שפורסם לפני10.
Protocol
Representative Results
Discussion
המסה ברזולוציה גבוהה של DNA היא פתרון פשוט עבור genotyping וריאנט גנטי סריקה14. זה תלוי בהבדלי רצף שגורמים להטרודלקסים שמשנים את צורת עקומת ההיתוך. סוגים שונים של וריאנטים גנטיים עם תדרים מגוונים ניתן לראות בגן ספציפי עבור קבוצה מסוימת שלחוליםעם סרטן 1,2</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לכל המומחים והעובדים האקדמיים במעבדה ההמטולוגית המיוחדת, במחלקה להמטולוגיה, במחלקה לרפואה פנימית, במרכז הרפואי האוניברסיטאי לובליאנה.
Materials
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
References
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) – More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. . QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. . High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. . High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D. Agarose Gel Electrophoresis. Current Protocols in Immunology. 2, (1992).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
