الكشف الجيني المتغير في الجين CALR باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة
Summary
تحليل ذوبان عالية الدقة (إدارة الموارد البشرية) هو حل حساس وسريع للكشف عن المتغير الجيني. ذلك يعتمد على الاختلافات التسلسل التي تؤدي إلى تغيير شكل heteroduplexes منحنى ذوبان. من خلال تمشيط HRM و agarose هلام الكهربائي، يمكن تحديد أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية مثل indels.
Abstract
تحليل ذوبان عالية الدقة (إدارة الموارد البشرية) هو وسيلة قوية لل genotyping والمسح الجيني الاختلاف. تعتمد معظم تطبيقات إدارة الموارد البشرية على تشبع أصباغ الحمض النووي التي تكشف عن اختلافات التسلسل ، واللاتيرودوبلس التي تغير شكل منحنى الذوبان. وهناك حاجة إلى دقة ممتازة للصك وبرامج خاصة لتحليل البيانات لتحديد الاختلافات الصغيرة في منحنى الذوبان التي تحدد متغيرا أو نمطا جينيا. يمكن ملاحظة أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية ذات الترددات المتنوعة في الجين المحدد للمرضى الذين يعانون من مرض معين ، وخاصة السرطان وفي جين CALR في المرضى الذين يعانون من الأورام النقوية النقوية السالبة للكروموسوم في فيلادلفيا. يمكن الكشف عن التغيرات النيوكليوتيدات واحد، الإدراج و / أو الحذف (indels) في الجين من الفائدة من خلال تحليل إدارة الموارد البشرية. ويستند تحديد أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية في الغالب على الضوابط المستخدمة في فحص إدارة الموارد البشرية QPCR. ومع ذلك ، مع زيادة طول المنتج ، يصبح الفرق بين منحنيات البرية والهتيروزيجوتي أصغر ، ونوع المتغير الجيني أكثر صعوبة في تحديده. لذلك ، حيث indels هي البديل الجيني السائد المتوقع في جين الاهتمام ، يمكن استخدام طريقة إضافية مثل إلكتروفورسيس هلام الآغاروز لتوضيح نتيجة إدارة الموارد البشرية. في بعض الحالات، يجب إعادة فحص/إعادة تشخيص نتيجة غير حاسمة من خلال تسلسل سانجر القياسي. في هذه الدراسة بأثر رجعي، طبقنا هذه الطريقة على JAK2 V617F-المرضى الذين يعانون من MPN.
Introduction
تم التعرف على المتغيرات الوراثية الجسدية في جين السعرات الحرارية(CALR)في عام 2013 في المرضى الذين يعانون من الأورام النقوية (MPN) مثل تجلط الدم الأساسي والتليف النقوي الأولي1،2. ومنذ ذلك الحين، تم اكتشاف أكثر من 50 متغيرا جينيا في جين CALR، مما أدى إلى تحول إطاري +1 (−1+2)3. المتغيران الجينيان الأكثر شيوعا في CALR هما حذف 52 bp (NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52، p.(Leu367Thrfs*46))، وتسمى أيضا طفرة من النوع 1، وإدخال 5 bp (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC، p.(Lys385Asnfs*47))، وتسمى أيضا طفرة النوع 2. يمثل هذان المتغيران الجينيان 80٪ من جميع المتغيرات الجينية CALR. وقد صنفت الأخرى على أنها نوع 1-مثل أو نوع 2-مثل استخدام خوارزميات على أساس الحفاظ على الحلزون α قريبة من نوع البرية CALR4. هنا، نقدم واحدة من الطرق الحساسة للغاية والسريعة للكشف عن المتغير الجيني CALR، وطريقة تحليل ذوبان عالية الدقة (HRM). تمكن هذه الطريقة من الكشف السريع عن المتغيرات الجينية من النوع 1 والنوع 2 ، والتي تمثل غالبية طفرات CALR 5. وقدم إدارة الموارد البشرية في تركيبة مع الوقت الحقيقي »تفاعل البوليميراز المتسلسل« (qPCR) في عام 1997 كأداة للكشف عن طفرة في عامل V لايدن6. بالمقارنة مع تسلسل سانجر الذي يمثل تقنية المعيار الذهبي ، فإن إدارة الموارد البشرية هي طريقة أكثر حساسية وأقل تحديدا5. طريقة إدارة الموارد البشرية هي طريقة فحص جيدة تمكن من التحليل السريع لعدد كبير من العينات مع فائدة كبيرة من حيث التكلفة5. وهو أسلوب PCR بسيطة يؤديها في وجود صبغة الفلورسنت ولا تتطلب مهارات محددة. فائدة أخرى هي أن الإجراء نفسه لا يضر أو يدمر العينة التي تم تحليلها التي تسمح لنا بإعادة استخدام العينة لتسلسل الكهربائي أو سانجر بعد إجراء إدارة الموارد البشرية7. العيب الوحيد هو أنه من الصعب في بعض الأحيان تفسير النتائج. بالإضافة إلى ذلك، لا تكتشف إدارة الموارد البشرية الطفرة الدقيقة في المرضى الذين يعانون من طفرات غير من النوع 1 أو النوع2 8. في هؤلاء المرضى، ينبغي تنفيذ تسلسل سانجر(الشكل 1).
وتستند إدارة الموارد البشرية على تضخيم منطقة الحمض النووي المحددة في وجود صبغة فلورية الحمض النووي المشبعة ، والتي يتم دمجها في الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل (dsDNA). تنبعث من الصبغة الفلورية ضوء عند دمجها في dsDNA. بعد زيادة تدريجية في درجة الحرارة، dsDNA ينهار إلى الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل، والتي يمكن الكشف عنها على منحنى ذوبان كانخفاض مفاجئ في كثافة الفلورية. يعتمد شكل منحنى الذوبان على تسلسل الحمض النووي الذي يستخدم للكشف عن الطفرة. تتم مقارنة منحنيات ذوبان العينات بمنحنيات ذوبان الطفرات المعروفة أو CALR البرية. تمثل منحنيات الذوبان المتميزة طفرة مختلفة غير من النوع 1 أو النوع 29.
خوارزمية الكشف عن المتغير الجيني الجسدي في الجين CALR بواسطة إدارة الموارد البشرية، أجاروز هلام electrophoresis وطريقة التسلسل(الشكل 1)تم استخدامها والتحقق من صحتها في الدراسة بأثر رجعي نشرت قبل10.
Protocol
Representative Results
Discussion
ذوبان عالية الدقة من الحمض النووي هو حل بسيط ل genotyping والمسح الجيني المتغير14. يعتمد ذلك على اختلافات التسلسل التي تؤدي إلى الترودوبليكس التي تغير شكل منحنى الذوبان. يمكن ملاحظة أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية ذات الترددات المتنوعة في الجين المحدد لمجموعة معينة من المرضى ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا جميع الخبراء الأكاديميين والموظفين في مختبر أمراض الدم المتخصص، قسم أمراض الدم، شعبة الطب الباطني، المركز الطبي الجامعي ليوبليانا.
Materials
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
References
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) – More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. . QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. . High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. . High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D. Agarose Gel Electrophoresis. Current Protocols in Immunology. 2, (1992).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
