Summary

Geração livre de células neuronais derivadas do sangue

Published: February 13, 2021
doi:

Summary

Apresentamos um método geneticamente livre de modificações (livre de GM) para obter células com um fenótipo neuronal de células sanguíneas periféricas reprogramadas. A ativação de uma via de sinalização ligada à nova proteína ligada ao GPI humano revela um método eficiente livre de GM para a obtenção de células-tronco pluripotentes humanas.

Abstract

Muitas doenças neurológicas humanas são causadas pela degeneração de neurônios e células gliais no cérebro. Devido a limitações em estratégias farmacológicas e outras terapêuticas, atualmente não há cura disponível para o cérebro ferido ou doente. A substituição celular aparece como uma estratégia terapêutica promissora para condições neurodegenerativas. Até hoje, as células-tronco neurais (NSCs) foram geradas com sucesso a partir de tecidos fetais, células embrionárias humanas (ES) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). Um processo de desdiferente foi iniciado pela ativação da nova glicoproteína ligada ao GPI humano, que leva à geração de células-tronco pluripotentes. Essas células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs) diferenciam in vitro em células com um fenótipo neural, como mostrado por microscopia de campo brilhante e imunofluorescência. A análise ultraestrutural dessas células por meio da microscopia eletrônica confirma sua estrutura primitiva, bem como morfologia neuronal e características subcelulares.

Introduction

O desenvolvimento de métodos básicos e pré-clínicos de pesquisa de células-tronco incentiva a aplicação clínica de terapias baseadas em células-tronco para doenças neurológicas. Tal terapia potencial depende criticamente do método de geração de células neurais humanas que leve à recuperação funcional1.

As células-tronco neurais (NSCs) se auto-renovam e se diferenciam em novos neurônios ao longo da vida em um processo chamado neurogênese adulta. Apenas áreas cerebrais muito restritas abrigam NSCs competentes para gerar neurônios recém-nascidos na idade adulta. Tais NSCs podem dar origem a neurônios maduros, que estão envolvidos no aprendizado e na memória, substituindo assim neurônios perdidos ou danificados. Infelizmente, essas NSCs estão presentes em quantidades restritas e essa neurogênese limitada diminui rapidamente durante o desenvolvimento juvenil2. Portanto, outras fontes de células neurais devem ser consideradas em um objetivo de terapia celular.

Doenças neurológicas degenerativas são difíceis de curar usando abordagens farmacológicas padrão. Novas estratégias terapêuticas para abraçar muitas doenças neurológicas imensuráveis são baseadas em terapias de substituição celular de tecido doente e ferido. O transplante de NSC pode substituir células danificadas e fornecer efeitos benéficos. Outras fontes para a substituição de células neurais incluem células-tronco embrionárias humanas (ESC), que são derivadas da massa celular interna dos blastocistos3,bem como iPSCs4,que têm ampla capacidade de auto-renovação como eSCs e são capazes de se diferenciar em várias linhagens celulares. Os NSCs também podem ser gerados pela reprogramação direta de fibroblastos humanos evitando o estado pluripotente5.

A terapia de reposição celular ainda é uma questão desafiadora. Embora a ESC, fetal ou iPS possa ser uma fonte para a geração de células neuronais para o tratamento de muitas doenças neurológicas incuráveis, a substituição celular de SCs adultos autólogos de tecidos danificados é uma alternativa melhor que contorna preocupações imunológicas, éticas e de segurança.

Ativação da proteína ligada ao GPI humano por ligação de anticorpos via fosforilação de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN inicia uma dediferenciação de células progenitoras sanguíneas e geração de células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs)6. Essas células se diferenciam in vitro em relação às células neuronais, como confirmado por meio de análise de campo brilhante, imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão (TEM).

Neste trabalho descrevemos a geração livre de BD-PSCs e sua diferenciação bem sucedida em células com fenótipo neuronal.

Protocol

As aprovações éticas foram obtidas na realização dos experimentos. 1. Isolamento das células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMNCs) Certifique-se de que todos os doadores assinaram consentimento informado antes da retirada de sangue em conformidade com as diretrizes institucionais. Tome 30 mL de sangue de doadores saudáveis por pessoal médico treinado de acordo com o protocolo padrão. Isole pbmncs por mídia gradiente de densidade. Use 10 m…

Representative Results

Os resultados fornecem evidências de que este novo método livre de GM é capaz de reverter células progenitoras de sangue para seu estado mais primitivo sem agir diretamente sobre o genoma humano. Já mostramos anteriormente que o crosslinking de anticorpos específicos ligados ao GPI inicia-se via PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation de genes altamente conservados de desenvolvimento relevantes como WNT, NOTCH e C-Kit, iniciando assim um processo de desdiferenteização que leva a…

Discussion

O método não-GM de reprogramação de células humanas descrito neste trabalho baseia-se na ativação da membrana ao núcleo de máquinas de sinalização por trás da glicoproteína de membrana humana ligada ao GPI que inicia o processo de desdiferenciação levando à geração ex vivo e à expansão de PSCs auto-renovados obtidos a partir de sangue periférico humano não manipulado. Essas células quando cultivadas em meios apropriados são capazes de se diferenciar em células pertencentes a diferentes c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dedicado à memória do Dr. Rainer Saffrich.

Os autores são especialmente gratos a José Manuel García-Verdugo e Vicente Herranz-Pérez por realizarem experimentos e análises em EM no Laboratório de Neurobiologia Comparada, Instituto Cavanilles de Biodiversidade e Biologia Evolutiva, Universidade de Valência, CIBERNED, Valência, Espanha, que foi apoiado por financiamento de pesquisa do Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. O resto deste trabalho foi apoiado pela ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Alemanha.
 

Materials

Albumin Fraction V Roth T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate Merck Millipore MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 Merck Millipore MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488 Merck Millipore MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 BD Pharmingen 560381
AO/PI Cell Viability kit Biozym 872045 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes Sigma Aldrich A8960-5G
B27 Serum free 50x Fisher Scientific (Gibco) 11530536
Basic FGF solution Fisher Scientific (Gibco) 10647225
Biocoll Merck Millipore L6115-BC density gradient media
BSA Frac V 7.5% Gibco 15260037
CD45 MicroBeads Miltenyi 130-045-801 nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna Biozym 872010 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek Fisher Scientific 10234121
D-MEM/F12 Merck Millipore FG4815-BC
Durcupan Sigma Aldrich 44610 epoxy resin
FBS Merck Millipore S0115/1030B Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human Fisher Scientific (Gibco) 10679963
GlutaMax 100x Gibco 35050038 L-glutamine
Glutaraldehyde grade Sigma-Aldrich G5882-50ML
Heparin sodium cell Sigma-Aldrich H3149-50KU
Human BDNF Fisher Scientific (Gibco) 11588836
Iscove (IMDM) Biochrom FG0465
Laminin mouse Fisher Scientific (Gibco) 10267092
Lead citrate Sigma-Aldrich 15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter Biozym 872040 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer Miltenyi 130-091-221
MEM NEAA 100x Gibco 11140035
MiniMACS Trennsäulen Miltenyi 130-042-201
Morada digital camera Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells Fisher Scientific 10507591
N2 Supplement 100x Fisher Scientific (Gibco) 11520536
Neurobasal Medium Gibco 10888022
PBS sterile Roth 9143.2
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit FEI Europe
Ultracut UC-6 Leica
Uranyl acetate C EMS 22400

References

  1. Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
  2. Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
  6. Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
  7. Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
  8. Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
  9. Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
  10. Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
  11. Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
  12. Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).

Play Video

Cite This Article
Becker-Kojić, Z. A., Schott, A., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (168), e61634, doi:10.3791/61634 (2021).

View Video