Summary

GM-vrije generatie van bloed-afgeleide neuronale cellen

Published: February 13, 2021
doi:

Summary

We presenteren een genetisch gemodificeerde vrije (GM-vrije) methode om cellen met een neuronaal fenotype te verkrijgen uit geherprogrammeerde perifere bloedcellen. Activering van een signaleringsroute gekoppeld aan nieuwe menselijke GPI-gebonden eiwitten onthult een efficiënte GM-vrije methode voor het verkrijgen van menselijke pluripotente stamcellen.

Abstract

Veel menselijke neurologische aandoeningen worden veroorzaakt door degeneratie van neuronen en gliacellen in de hersenen. Vanwege beperkingen in farmacologische en andere therapeutische strategieën is er momenteel geen remedie beschikbaar voor de gewonde of zieke hersenen. Celvervanging verschijnt als een veelbelovende therapeutische strategie voor neurodegeneratieve aandoeningen. Tot op de dag van vandaag zijn neurale stamcellen (NSC’s) met succes gegenereerd uit foetale weefsels, menselijke embryonale cellen (ES) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC). Een proces van dedifferentiatie werd geïnitieerd door activering van het nieuwe menselijke GPI-gebonden glycoproteïne, wat leidt tot de generatie van pluripotente stamcellen. Deze van bloed afgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC’s) onderscheiden in vitro in cellen met een neuraal fenotype, zoals blijkt uit brightfield- en immunofluorescentiemicroscopie. Ultrastructurele analyse van deze cellen door middel van elektronenmicroscopie bevestigt hun primitieve structuur, neuronale morfologie en subcellulaire kenmerken.

Introduction

De ontwikkeling van basis- en preklinische stamcelonderzoeksmethoden stimuleert de klinische toepassing van stamcelgebaseerde therapieën voor neurologische ziekten. Een dergelijke potentiële therapie hangt kritisch af van de methode voor het genereren van menselijke neurale cellen die leidt tot functioneel herstel1.

Neurale stamcellen (NSC’s) vernieuwen zichzelf en differentiëren zich gedurende het hele leven in nieuwe neuronen in een proces dat volwassen neurogenese wordt genoemd. Alleen zeer beperkte hersengebieden herbergen NSC’s die bevoegd zijn om pasgeboren neuronen op volwassen leeftijd te genereren. Dergelijke NSC’s kunnen aanleiding geven tot volwassen neuronen, die betrokken zijn bij leren en geheugen, waardoor verloren of beschadigde neuronen worden vervangen. Helaas zijn deze NSC’s in beperkte hoeveelheden aanwezig en neemt deze beperkte neurogenese snel af tijdens de ontwikkeling van de juvenieleontwikkeling 2. Daarom moeten andere bronnen van neurale cellen worden overwogen in een celtherapiedoelstelling.

Degeneratieve neurologische ziekten zijn moeilijk te genezen met behulp van standaard farmacologische benaderingen. Nieuwe therapeutische strategieën voor het omarmen van veel immedicable neurologische aandoeningen zijn gebaseerd op celvervangende therapieën van ziek en gewond weefsel. NSC-transplantatie kan beschadigde cellen vervangen en gunstige effecten hebben. Andere bronnen voor neurale celvervanging zijn menselijke embryonale stamcellen (ESC), die zijn afgeleid van de binnencelmassa van zoogdierblastocysten3, evenals iPSC’s4, die een uitgebreid zelfvernieuwingsvermogen hebben zoals ESC’s en in staat zijn om zich te onderscheiden in verschillende cellijnen. NSC’s kunnen ook worden gegenereerd door directe herprogrammering van menselijke fibroblasten die pluripotente toestand vermijden5.

Celvervangingstherapie is nog steeds een uitdagend probleem. Hoewel ESC, foetale of iPS een bron kan zijn voor het genereren van neuronale cellen voor de behandeling van veel ongeneeslijke neurologische ziekten, is autologe volwassen SCs-celvervanging van beschadigde weefsels een beter alternatief dat immunologische, ethische en veiligheidsproblemen omzeilt.

Activering van humaan GPI-gebonden eiwit door antilichaam-crosslinking via fosforylering van PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initieert een dedifferentiatie van bloedvoorlopercellen en degeneratie van van bloed afgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC’s)6. Deze cellen onderscheiden in vitro naar neuronale cellen zoals bevestigd door middel van brightfield, immunofluorescentie en transmissie elektronenmicroscopie (TEM) analyse.

In dit werk beschrijven we de GM-vrije generatie van BD-PSC’s en hun succesvolle herdifferentiatie in cellen met neuronaal fenotype.

Protocol

Ethische goedkeuringen werden verkregen bij het uitvoeren van de experimenten. 1. Isolatie van menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMNCs) Zorg ervoor dat alle donoren geïnformeerde toestemming hebben ondertekend voordat het bloed zich terugtrok in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. Neem 30 ml bloed van gezonde donoren door opgeleid medisch personeel volgens het standaardprotocol. Isoleer PBMNCs op dichtheidsgradiëntmedia. Gebruik 10 m…

Representative Results

De resultaten leveren bewijs dat deze nieuwe GM-vrije methode in staat is om bloed voorlopercellen terug te brengen naar hun meest primitieve toestand zonder direct in te werken op het menselijk genoom. We hebben eerder aangetoond dat GPI-gebonden eiwitspecifieke antilichaam crosslinking initieert via PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulatie van sterk geconserveerde ontwikkelingsrelevante genen zoals WNT, NOTCH en C-Kit, waardoor een proces van dedifferentiatie wordt gestart dat leidt tot…

Discussion

De niet-GM-methode voor het herprogrammeren van menselijke cellen die in dit werk wordt beschreven, is gebaseerd op membraan-naar-kernactivering van signaleringsmachines achter het GPI-gebonden menselijke membraanglycoproteïne dat het proces van dedifferentiatie initieert dat leidt tot de ex vivo generatie en uitbreiding van zelfvernieuwende PSC’s verkregen uit niet-gemanipuleerd menselijk perifeer bloed. Deze cellen kunnen, wanneer ze in geschikte media worden gekweekt, opnieuw differentiëren in cellen die to…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Opgedragen aan de nagedachtenis van Dr. Rainer Saffrich.

De auteurs zijn josé Manuel García-Verdugo en Vicente Herranz-Pérez bijzonder dankbaar voor het uitvoeren van EM-experimenten en -analyses in het Laboratorium voor Vergelijkende Neurobiologie, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, Universiteit van Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanje, dat werd ondersteund door onderzoeksfinanciering van de Prometeo Grant for Excellence Onderzoeksgroepen PROMETEO/2019/075. De rest van dit werk werd ondersteund door ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Duitsland.
 

Materials

Albumin Fraction V Roth T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate Merck Millipore MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 Merck Millipore MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488 Merck Millipore MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 BD Pharmingen 560381
AO/PI Cell Viability kit Biozym 872045 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes Sigma Aldrich A8960-5G
B27 Serum free 50x Fisher Scientific (Gibco) 11530536
Basic FGF solution Fisher Scientific (Gibco) 10647225
Biocoll Merck Millipore L6115-BC density gradient media
BSA Frac V 7.5% Gibco 15260037
CD45 MicroBeads Miltenyi 130-045-801 nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna Biozym 872010 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek Fisher Scientific 10234121
D-MEM/F12 Merck Millipore FG4815-BC
Durcupan Sigma Aldrich 44610 epoxy resin
FBS Merck Millipore S0115/1030B Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human Fisher Scientific (Gibco) 10679963
GlutaMax 100x Gibco 35050038 L-glutamine
Glutaraldehyde grade Sigma-Aldrich G5882-50ML
Heparin sodium cell Sigma-Aldrich H3149-50KU
Human BDNF Fisher Scientific (Gibco) 11588836
Iscove (IMDM) Biochrom FG0465
Laminin mouse Fisher Scientific (Gibco) 10267092
Lead citrate Sigma-Aldrich 15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter Biozym 872040 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer Miltenyi 130-091-221
MEM NEAA 100x Gibco 11140035
MiniMACS Trennsäulen Miltenyi 130-042-201
Morada digital camera Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells Fisher Scientific 10507591
N2 Supplement 100x Fisher Scientific (Gibco) 11520536
Neurobasal Medium Gibco 10888022
PBS sterile Roth 9143.2
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit FEI Europe
Ultracut UC-6 Leica
Uranyl acetate C EMS 22400

References

  1. Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
  2. Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
  6. Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
  7. Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
  8. Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
  9. Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
  10. Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
  11. Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
  12. Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).

Play Video

Cite This Article
Becker-Kojić, Z. A., Schott, A., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (168), e61634, doi:10.3791/61634 (2021).

View Video