Summary

Génération sans OGM de cellules neuronales dérivées du sang

Published: February 13, 2021
doi:

Summary

Nous présentons une méthode (GM-free) génétiquement modifiée pour obtenir des cellules avec un phénotype neuronal des cellules sanguines périphériques reprogrammées. L’activation d’une voie de signalisation liée à une nouvelle protéine humaine liée au GPI révèle une méthode efficace sans OGM pour obtenir des cellules souches pluripotentes humaines.

Abstract

De nombreux troubles neurologiques humains sont causés par la dégénérescence des neurones et des cellules gliales dans le cerveau. En raison des limites des stratégies pharmacologiques et autres stratégies thérapeutiques, il n’y a actuellement aucun remède disponible pour le cerveau blessé ou malade. Le remplacement cellulaire apparaît comme une stratégie thérapeutique prometteuse pour des conditions neurodegenerative. À ce jour, des cellules souches neurales (CSCN) ont été générées avec succès à partir de tissus fœtaux, de cellules embryonnaires humaines (SE) ou de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Un processus de dédifférenciatation a été initié par l’activation de la glycoprotéine GPI-liée humaine nouvelle, qui mène à la génération des cellules souches pluripotentes. Ces cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSCs) différencient in vitro en cellules avec un phénotype neural comme montré par brightfield et microscopie d’immunofluorescence. L’analyse d’ultrastructure de ces cellules au moyen de la microscopie électronique confirme leur structure primitive aussi bien que neuronal-comme la morphologie et les caractéristiques subcellulaires.

Introduction

Le développement de méthodes de recherche fondamentale et préclinique sur les cellules souches encourage l’application clinique de thérapies à base de cellules souches pour les maladies neurologiques. Une telle thérapie potentielle dépend de manière critique de la méthode de génération de cellules neurales humaines conduisant à la récupération fonctionnelle1.

Les cellules souches neurales (CNS) s’auto-renouvellent et se différencient en nouveaux neurones tout au long de la vie dans un processus appelé neurogenèse adulte. Seules les zones cérébrales très restreintes abritent des NSC compétents pour générer des neurones nouveau-nés à l’âge adulte. Ces NSCs peuvent donner naissance à des neurones matures, qui sont impliqués dans l’apprentissage et la mémoire, remplaçant ainsi les neurones perdus ou endommagés. Malheureusement, ces NSC sont présents en quantités restreintes et cette neurogenèse limitée diminue rapidement au cours du développement juvénile2. Par conséquent, d’autres sources de cellules neurales doivent être considérées dans un objectif de thérapie cellulaire.

Les maladies neurologiques dégénératives sont difficiles à guérir en utilisant des approches pharmacologiques standard. De nouvelles stratégies thérapeutiques pour embrasser de nombreux troubles neurologiques immédicables sont basées sur des thérapies de remplacement cellulaire de tissus malades et blessés. La transplantation de NSC pourrait remplacer les cellules endommagées et fournir des bienfaits. D’autres sources de remplacement des cellules neurales comprennent les cellules souches embryonnaires humaines (ESC), qui sont dérivées de la masse cellulaire interne des blastocystes mammifères3, ainsi que les cspi4, qui ont une grande capacité d’auto-renouvellement comme les CSE et sont capables de se différencier en diverses lignées cellulaires. Les NSC peuvent également être générés par reprogrammation directe à partir de fibroblastes humains évitant l’état pluripotent5.

La thérapie de remplacement cellulaire est toujours un problème difficile. Bien que l’ESC, le fœtus ou l’iPS puissent être une source de génération de cellules neuronales pour traiter de nombreuses maladies neurologiques incurables, le remplacement autologue des cellules de SC adultes des tissus endommagés est une meilleure alternative qui contourne les préoccupations immunologiques, éthiques et de sécurité.

L’activation de la protéine humaine liée au GPI par réticulation d’anticorps via la phosphorylation de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN déclenche une dédifférenciatation des cellules progénitrices sanguines et la génération de cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSCs)6. Ces cellules différencient in vitro vers les cellules neuronales comme confirmé au moyen de brightfield, d’immunofluorescence et d’analyse par microscopie électronique à transmission (TEM).

Dans ce travail nous décrivons la génération GM-libre de BD-PSCs et leur re-différenciation réussie en cellules avec le phénotype neuronal.

Protocol

Des approbations éthiques ont été obtenues lors de la réalisation des expériences. 1. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMNCs) S’assurer que tous les donneurs ont signé un consentement éclairé avant le prélèvement sanguin conformément aux lignes directrices de l’établissement. Prendre 30 ml de sang de donneurs sains par un personnel médical qualifié selon le protocole standard. Isolez les PBMNCs par support de…

Representative Results

Les résultats fournissent la preuve que cette nouvelle méthode sans OGM est capable de rétablir les cellules progénitrices du sang à leur état le plus primitif sans agir directement sur le génome humain. Nous avons précédemment montré que la réticulation des anticorps spécifiques aux protéines liées au GPI initie via la régulation à la hausse PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN de gènes hautement conservés pertinents pour le développement tels que WNT, NOTCH et C-Kit, initiant…

Discussion

La méthode non-GM de reprogrammation des cellules humaines décrite dans ce travail est basée sur l’activation de membrane à noyau de la ou des machines de signalisation derrière la glycoprotéine de membrane humaine liée au GPI qui initie le processus de dédifférenciatation menant à la génération ex vivo et à l’expansion de PSCs autorenouvants obtenus à partir de sang périphérique humain non manipulé. Ces cellules, lorsqu’elles sont cultivées dans des milieux appropriés, sont capables de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dédié à la mémoire du Dr Rainer Saffrich.

Les auteurs sont particulièrement reconnaissants à José Manuel García-Verdugo et Vicente Herranz-Pérez d’avoir effectué des expériences et des analyses em au Laboratoire de neurobiologie comparative, Institut de biodiversité et de biologie évolutive de Cavanilles, Université de Valence, CIBERNED, Valence, Espagne, qui a été soutenu par un financement de recherche de la subvention Prometeo pour les groupes de recherche d’excellence PROMETEO/2019/075. Le reste de ces travaux a été soutenu par ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Allemagne.
 

Materials

Albumin Fraction V Roth T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate Merck Millipore MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 Merck Millipore MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488 Merck Millipore MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 BD Pharmingen 560381
AO/PI Cell Viability kit Biozym 872045 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes Sigma Aldrich A8960-5G
B27 Serum free 50x Fisher Scientific (Gibco) 11530536
Basic FGF solution Fisher Scientific (Gibco) 10647225
Biocoll Merck Millipore L6115-BC density gradient media
BSA Frac V 7.5% Gibco 15260037
CD45 MicroBeads Miltenyi 130-045-801 nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna Biozym 872010 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek Fisher Scientific 10234121
D-MEM/F12 Merck Millipore FG4815-BC
Durcupan Sigma Aldrich 44610 epoxy resin
FBS Merck Millipore S0115/1030B Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human Fisher Scientific (Gibco) 10679963
GlutaMax 100x Gibco 35050038 L-glutamine
Glutaraldehyde grade Sigma-Aldrich G5882-50ML
Heparin sodium cell Sigma-Aldrich H3149-50KU
Human BDNF Fisher Scientific (Gibco) 11588836
Iscove (IMDM) Biochrom FG0465
Laminin mouse Fisher Scientific (Gibco) 10267092
Lead citrate Sigma-Aldrich 15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter Biozym 872040 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer Miltenyi 130-091-221
MEM NEAA 100x Gibco 11140035
MiniMACS Trennsäulen Miltenyi 130-042-201
Morada digital camera Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells Fisher Scientific 10507591
N2 Supplement 100x Fisher Scientific (Gibco) 11520536
Neurobasal Medium Gibco 10888022
PBS sterile Roth 9143.2
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit FEI Europe
Ultracut UC-6 Leica
Uranyl acetate C EMS 22400

References

  1. Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
  2. Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
  6. Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
  7. Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
  8. Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
  9. Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
  10. Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
  11. Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
  12. Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).

Play Video

Cite This Article
Becker-Kojić, Z. A., Schott, A., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (168), e61634, doi:10.3791/61634 (2021).

View Video