GEN-freie Erzeugung von blutabgeleiteten neuronalen Zellen
Summary
Wir stellen eine gentechnisch veränderte (GV-freie) Methode vor, um Zellen mit einem neuronalen Phänotyp aus reprogrammierten peripheren Blutzellen zu gewinnen. Die Aktivierung eines Signalwegs, der mit einem neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Protein verbunden ist, zeigt eine effiziente GENV-freie Methode zur Gewinnung menschlicher pluripotenter Stammzellen.
Abstract
Viele neurologische Erkrankungen des Menschen werden durch die Degeneration von Neuronen und Gliazellen im Gehirn verursacht. Aufgrund von Einschränkungen in pharmakologischen und anderen therapeutischen Strategien gibt es derzeit keine Heilung für das verletzte oder erkrankte Gehirn. Zellersatz erscheint als vielversprechende therapeutische Strategie für neurodegenerative Erkrankungen. Bis heute werden neuronale Stammzellen (NSCs) erfolgreich aus fetalem Gewebe, menschlichen embryonalen Zellen (ES) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) erzeugt. Ein Prozess der Dedifferenzierung wurde durch die Aktivierung des neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Glykoproteins eingeleitet, das zur Erzeugung pluripotenter Stammzellen führt. Diese aus dem Blut gewonnenen pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs) differenzieren sich in vitro zu Zellen mit einem neuronalen Phänotyp, wie die Hellfeld- und Immunfluoreszenzmikroskopie zeigt. Die ultrastrukturelle Analyse dieser Zellen mittels Elektronenmikroskopie bestätigt ihre primitive Struktur sowie neuronale Morphologie und subzelluläre Eigenschaften.
Introduction
Die Entwicklung grundlegender und präklinischer Stammzellforschungsmethoden fördert die klinische Anwendung stammzellbasierter Therapien bei neurologischen Erkrankungen. Eine solche mögliche Therapie hängt entscheidend von der Methode zur Erzeugung menschlicher Nervenzellen ab, die zur funktionellen Erholung führen1.
Neuronale Stammzellen (NSCs) erneuern sich selbst und differenzieren sich im Laufe des Lebens in einem Prozess, der als adulte Neurogenese bezeichnet wird. Nur sehr eingeschränkte Hirnareel beherbergen NSCs, die in der Lage sind, neugeborene Neuronen im Erwachsenenalter zu erzeugen. Solche NSCs können reife Neuronen hervorbringen, die am Lernen und Gedächtnis beteiligt sind und so verlorene oder beschädigte Neuronen ersetzen. Leider sind diese NSCs in begrenzten Mengen vorhanden und diese begrenzte Neurogenese nimmt während der juvenilen Entwicklung schnell ab2. Daher müssen andere Quellen von Nervenzellen in einem Zelltherapieziel berücksichtigt werden.
Degenerative neurologische Erkrankungen sind mit pharmakologischen Standardansätzen schwer zu heilen. Neue therapeutische Strategien zur Umarmung vieler nicht medikamentöser neurologischer Erkrankungen basieren auf Zellersatztherapien von erkranktem und verletztem Gewebe. Die NSC-Transplantation könnte beschädigte Zellen ersetzen und positive Wirkungen erzielen. Andere Quellen für den Neuronalen Zellersatz sind humane embryonale Stammzellen (ESC), die aus der inneren Zellmasse der Säugetier-Blastozysten3gewonnen werden, sowie iPSCs4,die wie ESCs über eine umfangreiche Selbsterneuerungsfähigkeit verfügen und in der Lage sind, sich in verschiedene Zelllinien zu differenzieren. NSCs können auch durch direkte Reprogrammierung von menschlichen Fibroblasten erzeugt werden, wodurch der pluripotente Zustand5vermieden wird.
Die Zellersatztherapie ist nach wie vor ein herausforderndes Thema. Obwohl ESC, fetal oder iPS eine Quelle für die Erzeugung neuronaler Zellen zur Behandlung vieler unheilbarer neurologischer Erkrankungen sein können, ist der autologe adulte SCs-Zellersatz von beschädigtem Gewebe eine bessere Alternative, die immunologische, ethische und Sicherheitsbedenken umgeht.
Die Aktivierung des humanen GPI-verknüpften Proteins durch Antikörpervernetzung durch Phosphorylierung von PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initiiert eine Dedifferenzierung von Blutvorläuferzellen und die Erzeugung von blutabgeleiteten pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs)6. Diese Zellen differenzieren sich in vitro gegenüber neuronalen Zellen, wie durch Hellfeld-, Immunfluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt.
In dieser Arbeit beschreiben wir die GEN-freie Erzeugung von BD-PSCs und deren erfolgreiche Redifferenzierung in Zellen mit neuronalem Phänotyp.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in dieser Arbeit beschriebene Nicht-GM-Methode zur Reprogrammierung menschlicher Zellen basiert auf der Membran-zu-Kern-Aktivierung der Signalmaschinerie hinter dem GPI-verknüpften menschlichen Membranglykoprotein, das den Prozess der Dedifferenzierung einleitet, der zur Ex-vivo-Erzeugung und -Expansion von sich selbst erneuernden PSCs führt, die aus nicht manipuliertem menschlichem peripherem Blut gewonnen werden. Diese Zellen sind, wenn sie in geeigneten Medien kultiviert werden, in Zellen umzudifferenzi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dem Andenken an Dr. Rainer Saffrich gewidmet.
Die Autoren danken insbesondere José Manuel García-Verdugo und Vicente Herranz-Pérez für die Durchführung von EM-Experimenten und -Analysen am Labor für Vergleichende Neurobiologie, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, University of Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanien, die durch Forschungsmittel aus dem Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075 unterstützt wurden. Der Rest dieser Arbeit wurde von der ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Deutschland, unterstützt.
Materials
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
