Summary

GEN-freie Erzeugung von blutabgeleiteten neuronalen Zellen

Published: February 13, 2021
doi:

Summary

Wir stellen eine gentechnisch veränderte (GV-freie) Methode vor, um Zellen mit einem neuronalen Phänotyp aus reprogrammierten peripheren Blutzellen zu gewinnen. Die Aktivierung eines Signalwegs, der mit einem neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Protein verbunden ist, zeigt eine effiziente GENV-freie Methode zur Gewinnung menschlicher pluripotenter Stammzellen.

Abstract

Viele neurologische Erkrankungen des Menschen werden durch die Degeneration von Neuronen und Gliazellen im Gehirn verursacht. Aufgrund von Einschränkungen in pharmakologischen und anderen therapeutischen Strategien gibt es derzeit keine Heilung für das verletzte oder erkrankte Gehirn. Zellersatz erscheint als vielversprechende therapeutische Strategie für neurodegenerative Erkrankungen. Bis heute werden neuronale Stammzellen (NSCs) erfolgreich aus fetalem Gewebe, menschlichen embryonalen Zellen (ES) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) erzeugt. Ein Prozess der Dedifferenzierung wurde durch die Aktivierung des neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Glykoproteins eingeleitet, das zur Erzeugung pluripotenter Stammzellen führt. Diese aus dem Blut gewonnenen pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs) differenzieren sich in vitro zu Zellen mit einem neuronalen Phänotyp, wie die Hellfeld- und Immunfluoreszenzmikroskopie zeigt. Die ultrastrukturelle Analyse dieser Zellen mittels Elektronenmikroskopie bestätigt ihre primitive Struktur sowie neuronale Morphologie und subzelluläre Eigenschaften.

Introduction

Die Entwicklung grundlegender und präklinischer Stammzellforschungsmethoden fördert die klinische Anwendung stammzellbasierter Therapien bei neurologischen Erkrankungen. Eine solche mögliche Therapie hängt entscheidend von der Methode zur Erzeugung menschlicher Nervenzellen ab, die zur funktionellen Erholung führen1.

Neuronale Stammzellen (NSCs) erneuern sich selbst und differenzieren sich im Laufe des Lebens in einem Prozess, der als adulte Neurogenese bezeichnet wird. Nur sehr eingeschränkte Hirnareel beherbergen NSCs, die in der Lage sind, neugeborene Neuronen im Erwachsenenalter zu erzeugen. Solche NSCs können reife Neuronen hervorbringen, die am Lernen und Gedächtnis beteiligt sind und so verlorene oder beschädigte Neuronen ersetzen. Leider sind diese NSCs in begrenzten Mengen vorhanden und diese begrenzte Neurogenese nimmt während der juvenilen Entwicklung schnell ab2. Daher müssen andere Quellen von Nervenzellen in einem Zelltherapieziel berücksichtigt werden.

Degenerative neurologische Erkrankungen sind mit pharmakologischen Standardansätzen schwer zu heilen. Neue therapeutische Strategien zur Umarmung vieler nicht medikamentöser neurologischer Erkrankungen basieren auf Zellersatztherapien von erkranktem und verletztem Gewebe. Die NSC-Transplantation könnte beschädigte Zellen ersetzen und positive Wirkungen erzielen. Andere Quellen für den Neuronalen Zellersatz sind humane embryonale Stammzellen (ESC), die aus der inneren Zellmasse der Säugetier-Blastozysten3gewonnen werden, sowie iPSCs4,die wie ESCs über eine umfangreiche Selbsterneuerungsfähigkeit verfügen und in der Lage sind, sich in verschiedene Zelllinien zu differenzieren. NSCs können auch durch direkte Reprogrammierung von menschlichen Fibroblasten erzeugt werden, wodurch der pluripotente Zustand5vermieden wird.

Die Zellersatztherapie ist nach wie vor ein herausforderndes Thema. Obwohl ESC, fetal oder iPS eine Quelle für die Erzeugung neuronaler Zellen zur Behandlung vieler unheilbarer neurologischer Erkrankungen sein können, ist der autologe adulte SCs-Zellersatz von beschädigtem Gewebe eine bessere Alternative, die immunologische, ethische und Sicherheitsbedenken umgeht.

Die Aktivierung des humanen GPI-verknüpften Proteins durch Antikörpervernetzung durch Phosphorylierung von PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initiiert eine Dedifferenzierung von Blutvorläuferzellen und die Erzeugung von blutabgeleiteten pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs)6. Diese Zellen differenzieren sich in vitro gegenüber neuronalen Zellen, wie durch Hellfeld-, Immunfluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt.

In dieser Arbeit beschreiben wir die GEN-freie Erzeugung von BD-PSCs und deren erfolgreiche Redifferenzierung in Zellen mit neuronalem Phänotyp.

Protocol

Bei der Durchführung der Experimente wurden ethische Genehmigungen eingeholt. 1. Isolierung von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes (PBMNCs) Stellen Sie sicher, dass alle Spender eine Einwilligung nach Aufklärung unterzeichnet haben, bevor sie die Blutentzugskonformität in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchführen. Nehmen Sie 30 ml Blut von gesunden Spendern durch geschultes medizinisches Personal gemäß dem Standardprotokol…

Representative Results

Die Ergebnisse liefern Hinweise darauf, dass diese neuartige gentechnikfreie Methode in der Lage ist, Blutvorläuferzellen in ihren primitivsten Zustand zurückzusetzen, ohne direkt auf das menschliche Genom einzuwirken. Wir haben bereits gezeigt, dass die GPI-verknüpfte proteinspezifische Antikörpervernetzung über PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN eine Hochregulierung hochkonservierender entwicklungsrelevanter Gene wie WNT, NOTCH und C-Kit initiiert und damit einen Prozess der Dedifferenzi…

Discussion

Die in dieser Arbeit beschriebene Nicht-GM-Methode zur Reprogrammierung menschlicher Zellen basiert auf der Membran-zu-Kern-Aktivierung der Signalmaschinerie hinter dem GPI-verknüpften menschlichen Membranglykoprotein, das den Prozess der Dedifferenzierung einleitet, der zur Ex-vivo-Erzeugung und -Expansion von sich selbst erneuernden PSCs führt, die aus nicht manipuliertem menschlichem peripherem Blut gewonnen werden. Diese Zellen sind, wenn sie in geeigneten Medien kultiviert werden, in Zellen umzudifferenzi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dem Andenken an Dr. Rainer Saffrich gewidmet.

Die Autoren danken insbesondere José Manuel García-Verdugo und Vicente Herranz-Pérez für die Durchführung von EM-Experimenten und -Analysen am Labor für Vergleichende Neurobiologie, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, University of Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanien, die durch Forschungsmittel aus dem Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075 unterstützt wurden. Der Rest dieser Arbeit wurde von der ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Deutschland, unterstützt.
 

Materials

Albumin Fraction V Roth T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate Merck Millipore MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 Merck Millipore MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488 Merck Millipore MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 BD Pharmingen 560381
AO/PI Cell Viability kit Biozym 872045 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes Sigma Aldrich A8960-5G
B27 Serum free 50x Fisher Scientific (Gibco) 11530536
Basic FGF solution Fisher Scientific (Gibco) 10647225
Biocoll Merck Millipore L6115-BC density gradient media
BSA Frac V 7.5% Gibco 15260037
CD45 MicroBeads Miltenyi 130-045-801 nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna Biozym 872010 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek Fisher Scientific 10234121
D-MEM/F12 Merck Millipore FG4815-BC
Durcupan Sigma Aldrich 44610 epoxy resin
FBS Merck Millipore S0115/1030B Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human Fisher Scientific (Gibco) 10679963
GlutaMax 100x Gibco 35050038 L-glutamine
Glutaraldehyde grade Sigma-Aldrich G5882-50ML
Heparin sodium cell Sigma-Aldrich H3149-50KU
Human BDNF Fisher Scientific (Gibco) 11588836
Iscove (IMDM) Biochrom FG0465
Laminin mouse Fisher Scientific (Gibco) 10267092
Lead citrate Sigma-Aldrich 15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter Biozym 872040 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer Miltenyi 130-091-221
MEM NEAA 100x Gibco 11140035
MiniMACS Trennsäulen Miltenyi 130-042-201
Morada digital camera Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells Fisher Scientific 10507591
N2 Supplement 100x Fisher Scientific (Gibco) 11520536
Neurobasal Medium Gibco 10888022
PBS sterile Roth 9143.2
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit FEI Europe
Ultracut UC-6 Leica
Uranyl acetate C EMS 22400

References

  1. Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
  2. Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
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Cite This Article
Becker-Kojić, Z. A., Schott, A., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (168), e61634, doi:10.3791/61634 (2021).

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