الجيل الخالي من المعدلة وراثيا من الخلايا العصبية المشتقة من الدم
Summary
نحن نقدم طريقة خالية من المعدلة وراثيا (المعدلة وراثيا خالية) للحصول على الخلايا مع النمط الظاهري العصبية من خلايا الدم الطرفية المبرمجة. تنشيط مسار الإشارات المرتبطة بروتين الإنسان الجديد المرتبطة GPI يكشف عن طريقة فعالة خالية من المعدلة وراثيا للحصول على الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.
Abstract
تحدث العديد من الاضطرابات العصبية البشرية بسبب انحطاط الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الدماغ. بسبب القيود المفروضة في الاستراتيجيات الدوائية وغيرها من الاستراتيجيات العلاجية، لا يوجد حاليا علاج متاح للدماغ المصاب أو المريض. استبدال الخلايا يظهر كاستراتيجية علاجية واعدة للظروف العصبية. حتى يومنا هذا، تم إنشاء الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) بنجاح من أنسجة الجنين أو الخلايا الجنينية البشرية (ES) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC). بدأت عملية التمايز عن طريق تفعيل البروتين الجليكوبروتين البشري المرتبط ب GPI ، والذي يؤدي إلى توليد خلايا جذعية متعددة القدرات. هذه الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs) تفرق في المختبر إلى خلايا ذات النمط الظاهري العصبي كما هو مبين في المجهر الساطع والمناعة. يؤكد التحليل الهيكلي الفائق لهذه الخلايا عن طريق المجهر الإلكتروني بنيتها البدائية وكذلك مورفولوجيا تشبه الخلايا العصبية وخصائص دون الخلوية.
Introduction
تطوير طرق أبحاث الخلايا الجذعية الأساسية وقبل السريرية يشجع التطبيق السريري للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية للأمراض العصبية. يعتمد هذا العلاج المحتمل بشكل حاسم على طريقة توليد الخلايا العصبية البشرية مما يؤدي إلى الانتعاش الوظيفي1.
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) تجديد الذات وتفرق إلى خلايا عصبية جديدة طوال الحياة في عملية تسمى تكوين الأعصاب الكبار. فقط مناطق الدماغ المقيدة جدا تؤوي NSCs المختصة لتوليد الخلايا العصبية حديثي الولادة في مرحلة البلوغ. يمكن أن تؤدي هذه NSCs إلى خلايا عصبية ناضجة ، والتي تشارك في التعلم والذاكرة ، وبالتالي استبدال الخلايا العصبية المفقودة أو التالفة. لسوء الحظ، هذه NSCs موجودة بكميات محدودة وهذا التكوين العصبي المحدود ينخفض بسرعة خلال نمو الأحداث2. لذلك ، يجب النظر في مصادر أخرى للخلايا العصبية في هدف العلاج الخلوي.
من الصعب علاج الأمراض العصبية التنكسية باستخدام النهج الدوائية القياسية. وتستند استراتيجيات علاجية جديدة لاحتضان العديد من الاضطرابات العصبية التي لا يمكن عصبها على علاجات استبدال الخلايا من الأنسجة المريضة والمصابة. زرع NSC يمكن أن تحل محل الخلايا التالفة وتوفير آثار مفيدة. وتشمل المصادر الأخرى لاستبدال الخلايا العصبية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESC)، والتي تستمد من كتلة الخلية الداخلية من الكيسات الأريمية الثديية3، وكذلك iPSCs4، والتي لديها قدرة واسعة على التجديد الذاتي مثل ESCs وقادرة على التفريق إلى أنساب الخلايا المختلفة. ويمكن أيضا أن تنشأ NSCs عن طريق إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الليفية البشرية تجنب الدولة متعددة القدرات5.
العلاج ببدائل الخلايا لا يزال يمثل مشكلة صعبة. على الرغم من أن ESC أو الجنين أو iPS يمكن أن يكون مصدرا لتوليد الخلايا العصبية لعلاج العديد من الأمراض العصبية غير القابلة للشفاء ، فإن استبدال خلايا SCs البالغة الذاتية للأنسجة التالفة هو بديل أفضل يتحايل على المخاوف المناعية والأخلاقية والسلامة.
تفعيل البروتين البشري المرتبط ب GPI عن طريق ربط الأجسام المضادة عبر الفوسفور من PLCа/PI3K/Akt/mTor/PTEN يبدأ متمايزة خلايا سلف الدم وتوليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs)6. هذه الخلايا تفرق في المختبر نحو الخلايا العصبية كما أكد عن طريق التحليل المجهري للإلكترون برايتفيلد والمناعة وانتقال الإلكترون (TEM).
في هذا العمل نقوم بوصف الجيل الخالي من المعدلات وراثيا من BD-PSCs وإعادة تمايزها بنجاح إلى خلايا ذات النمط الظاهري العصبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعتمد طريقة إعادة برمجة الخلايا البشرية غير المعدلة وراثيا الموصوفة في هذا العمل على تنشيط الغشاء إلى النواة لآلات الإشارات (الآلات) وراء بروتين الغشاء البشري المرتبط ب GPI الذي يبدأ عملية التمايز مما يؤدي إلى توليد الجسم الحي السابق وتوسيع PSCs ذاتية التجديد التي يتم الحصول عليها من ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
مكرسة لذكرى الدكتور راينر سافريش.
يشعر المؤلفون بالامتنان بشكل خاص لخوسيه مانويل غارسيا فيردوغو وفيسنتي هيرانز بيريز على إجراء تجارب EM وتحليلها في مختبر البيولوجيا العصبية المقارنة، معهد كافانيليس للتنوع البيولوجي والبيولوجيا التطورية، جامعة فالنسيا، CIBERNED، فالنسيا، إسبانيا، والذي تم دعمه بتمويل بحثي من منحة بروميتيو لمجموعات أبحاث التميز PROMETEO/2019/075. بقية هذا العمل كان مدعوما من قبل ACA CELL التكنولوجيا الحيوية GmbH هايدلبرغ، ألمانيا.
Materials
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
