Kan Türevi Nöronal Hücrelerin GM'den Arındırılmış Üretimi
Summary
Yeniden programlanmış periferik kan hücrelerinden nöronal fenotip içeren hücreler elde etmek için genetiği değiştirilmiş (GM içermeyen) bir yöntem sunuyoruz. Yeni insan GPI bağlantılı proteine bağlı bir sinyal yolunun aktivasyonu, insan pluripotent kök hücrelerini elde etmek için verimli bir GM içermeyen yöntem ortaya koymaktadır.
Abstract
Birçok insan nörolojik bozukluğu, beyindeki nöronların ve glial hücrelerin dejenerasyonundan kaynaklanır. Farmakolojik ve diğer terapötik stratejilerdeki sınırlamalar nedeniyle, şu anda yaralı veya hastalıklı beyin için mevcut bir tedavi yoktur. Hücre replasmanı nörodejeneratif durumlar için umut verici bir terapötik strateji olarak ortaya çıkar. Bu güne kadar fetal dokulardan, insan embriyonik hücrelerinden (ES) veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC) nöral kök hücreler (NSC) başarıyla oluşturulmuştur. Pluripotent kök hücrelerin üretilmesine yol açan yeni insan GPI bağlantılı glikoproteinin aktivasyonu ile bir adanmışlık süreci başlatılmıştır. Bu kan türevli pluripotent kök hücreler (BD-PSC’ler) in vitroyu brightfield ve immünofluoresans mikroskopisinde gösterildiği gibi nöral fenotipli hücrelere ayırır. Bu hücrelerin elektron mikroskopisi ile ultrayapısal analizi, ilkel yapılarının yanı sıra nöronal benzeri morfoloji ve hücre altı özelliklerini doğrular.
Introduction
Temel ve klinik öncesi kök hücre araştırma yöntemlerinin geliştirilmesi, nörolojik hastalıklar için kök hücre temelli tedavilerin klinik olarak uygulanmasını teşvik eder. Bu tür potansiyel tedavi kritik fonksiyonel iyileşmeye yol açan insan sinir hücrelerinin üretimi için yönteme bağlıdır1.
Nöral kök hücreler (NSC’ler) yetişkin nörogenez adı verilen bir süreçte yaşam boyunca kendini yeniler ve yeni nöronlara ayırır. Sadece çok kısıtlı beyin bölgeleri, yetişkinlikte yenidoğan nöronları üretmeye yetkin NSC’leri barındırır. Bu tür NSC’ler, öğrenme ve hafızada yer alan olgun nöronlara yol açabilir, böylece kayıp veya hasarlı nöronların yerini alabilir. Ne yazık ki, bu NSC’ler sınırlı miktarlarda bulunur ve bu sınırlı nörogenez çocuk gelişimi sırasında hızla azalır2. Bu nedenle, diğer sinirsel hücre kaynakları bir hücre tedavisi hedefinde düşünülmelidir.
Dejeneratif nörolojik hastalıkların standart farmakolojik yaklaşımlar kullanılarak tedavisi zordur. Birçok eskiyen nörolojik bozukluğu kucaklamak için yeni terapötik stratejiler, hastalıklı ve yaralı dokunun hücre protezi tedavilerine dayanmaktadır. NSC transplantasyonu hasarlı hücrelerin yerini alabilir ve yararlı etkiler sağlayabilir. Nöral hücre değişimi için diğer kaynaklar arasında memeli blastosistler3’üniç hücre kütlesinden elde edilen insan embriyonik kök hücreleri (ESC) veESC’lergibi geniş kendini yenileme kapasitesine sahip ve çeşitli hücre soylarına farklılaşabilen iPSC 4 bulunur. NSC’ler ayrıca pluripotent durumdan kaçınarak insan fibroblastlarından doğrudan yeniden programlama ile de oluşturulabilir5.
Hücre replasman tedavisi hala zorlu bir konudur. ESC, fetal veya iPS birçok tedavi edilemez nörolojik hastalığın tedavisi için nöronal hücrelerin üretimi için bir kaynak olsa da, hasarlı dokuların otolog yetişkin SCS hücre değişimi, immünolojik, etik ve güvenlik endişelerini atlatan daha iyi bir alternatiftir.
İnsan GPI bağlantılı proteinin PLCφ/PI3K/Akt/mTor/PTEN fosforilasyonu yoluyla antikor-çapraz bağlama ile aktivasyonu, kan progenitör hücrelerinin ve kan türevli pluripotent kök hücrelerin (BD-PSC’ ler) üretimine adanmışlık başlatır6. Bu hücreler, parlak alan, immünofluoresans ve iletim elektron mikroskopisi (TEM) analizi ile doğrulanan nöronal hücrelere doğru in vitro farklılaşmaz.
Bu çalışmada, BD-PSC’lerin GM’den arındırılmış neslini ve nöronal fenotipli hücrelere başarılı bir şekilde yeniden ayırt etmelerini anlatıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada açıklanan insan hücrelerini yeniden programlamanın GM olmayan yöntemi, manipüle edilmemiş insan periferik kanından elde edilen ex vivo üretimine ve kendi kendini yenileyen PSC’lerin genişlemesine yol açan adanmışlık sürecini başlatan GPI bağlantılı insan membranı glikoproteinin arkasındaki sinyalizasyon (lar) makinelerinin çekirdek aktivasyonuna membran dayanmaktadır. Bu hücreler uygun ortamda kültürlendiğinde, farklı mikrop katmanlarına ait hücrelere yeniden ayırt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Rainer Saffrich’in anısına adanmış.
Yazarlar özellikle Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075 araştırma finansmanı ile desteklenen Karşılaştırmalı Nörobiyoloji Laboratuvarı, Cavanilles Biyoçeşitlilik ve Evrimsel Biyoloji Enstitüsü, Valencia Üniversitesi, CIBERNED, Valencia, İspanya’da EM deneyleri ve analizleri yaptıkları için José Manuel García-Verdugo ve Vicente Herranz-Pérez’e minnettardır. Bu çalışmanın geri kalanı ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Almanya tarafından desteklendi.
Materials
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
