単一細胞レベルでの形状依存性転写論の研究方法

動物に関するすべての手順は、カロリンスカ研究所、ストックホルム、スウェーデンの動物倫理委員会の規制に従っていました。 1. マイクロパターンチップレイアウト カスタム設計のチップ(材料表)(図1A):活性マイクロパターンを有する19.5mm x 19.5mmのカバースリップを、ホウケイ酸ガラスにフォトリソグラフィーで印刷した。注: これらのマイクロパターンは、サイトフォビック領域で囲まれています。したがって、シードされたセルは、これらのマイクロパターンの1つにしか付着して成長できず、そのマイクロパターンのARを捕捉することができます。チップは3つのゾーンに分けられ、各ゾーンは特定のARを持つマイクロパターンで構成されています。チップのレイアウトを図 1Bに示します。定義された AR のジオメトリは 、表 1に示されています。フィブロネクチンマイクロパターンの異なる形状の拡大蛍光画像は、 図1Bの下の画像に示されている。 2. マイクロパターン化されたチップをコーティングする 80 μgのフィブロネクチンをリン酸緩衝生理食塩水の 2 mL に加えて、各チップに 2x コーティングタンパク質溶液を調製します (PBS-/-)。 チップを35mmグライナーペトリ皿に移し、すぐに2 mLのPBSを追加します。その後、2xコーティングタンパク質溶液の2mLを加えます。 チップを室温で2時間インキュベートします。 PBS-/-で連続した希釈工程でコーティング液を洗浄します。チップ表面は常に濡れているはずです。次いで、2mLのめっき培地に置換し、細胞を播種するまで37°Cでインキュベートする。 3. CM の分離 DMEM:M199(4:1)を10%の馬血清、4%のウシ血清、2%HEPES(1 M)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U/mL)22で補ってメッキ培地を調製する。 2日前齢の新生児ラットの心臓の左心室から組織を解剖し、PBSを含む10cmの皿に移す。約1mm3 個に組織を切断します。 収穫した組織をローターキャップチューブに移し、組織解離用キャップにローターを装着(材料表)。組織を落ち着かせ、上清を慎重に取り除きます。 Cチューブに、新生児心臓解離キット(材料表)を使用して調製した酵素ミックス1と2の混合物の2.5 mLを加え、キャップをしっかりと閉じます。 ローターキャップチューブを、ヒーター(図2AとB)を装備した解離器のスリーブに挿入します(材料表)。インキュベーション プログラムを実行37C_mr_NHDK_1 (図 2C)を実行します。 インキュベーションプログラムが実行されている間、PBS、pH 7.2で2 mM EDTAおよび0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPEBバッファーを調製し、4°Cに保ちます。 インキュベーションプログラム終了後、ローターキャップチューブ(図2D)を取り外し、7.5mLのプレウォームメッキ媒体を追加します。 サンプルを再中断し、70 μmのストレーナーを使用して細胞懸濁液をフィルター処理します。 ストレーナーを別の3mLのメッキ媒体で洗います。 600 x g で細胞懸濁液を5分間遠心分離する。上清を完全に吸引する。 60 μLのコールド PEB バッファーに細胞ペレットを再懸濁します。 非CMを対象とするミクロンサイズのビーズを含む新生児心筋細胞分離カクテル(材料表)を20μL追加します。 20 μL の抗赤血球ビーズを加える(材料表)。 懸濁液を混ぜ、4°Cで15分間インキュベートします。 400 μL の PEB バッファを追加します。 セル懸濁液をLDカラム(材料表)に塗布し、マグネットスタンドに垂直に挿入し、PEBバッファーでよく洗浄します。 ラベルのない細胞を収集し、PEBバッファーの0.5 mLでカラムを洗浄します。 8 mLのメッキ培地を加え、細胞懸濁液を75cm2 の未コーティング培養フラスコに移し、37°Cで1.5時間インキュベートする。残りの非CMは非コーティングされた細胞培養に付着し始め、細胞懸濁液はCM集団によって濃縮される。 4. CM のパターン化 注: 1 つの CM と 1:1、7:1、または 11:1 の AR を比較しました。これは、1:1、7:1または11:1の定義されたARsを備えたフィブロネクチンコーティングされたマイクロパターンで満たされた特別に設計されたチップに分離された新生児ラットCMを播種することによって行われます。マイクロパターンをフィブロネクチンによってコーティングし、サイトフォビック表面で囲んだ。したがって、CMはフィブロネクチン基板上で成長させることによって、マイクロパターンの定義されたARを取り付け、広げ、捕獲します。次の手順に従って、分離された CM をパターン化します。 細胞懸濁液を15mLチューブに移し、適切なめっき培地を添加して細胞を1mL当たり10万細胞の濃度まで希釈して数えた。 35mmグライナーペトリ皿の中に2mLの温かいめっき媒体に既に沈められているチップに2mLの細胞懸濁液を加えます。 37°Cで5%CO2で皿をインキュベートし、CMをフィブロネクチンコーティングされたマイクロパターンに取り付け、各CMがその基板マイクロパターンのARを取得できるようにします。 18時間後、チップを確認します。ほとんどの細胞が結合している場合は、パターン化された細胞に付着した破片および死んだ細胞を取り外して取り除きます。これを行うには、めっき媒体を取り除き、PBS-/- ドロップワイズを穏やかに加え、チップの中心から側面に向かって移動します。2回繰り返します。 DMEM:M199(4:1)に4%の馬の血清、4%のウシ血清、2%HEPES(1 M)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U/mL)を補充することによって、新鮮な維持培地でPBSを吸引する。 5. 付着 CD のピッキング 注: 72 時間の培養期間の後、パターン化された単一の CM は、半自動化されたセル ピッカー (表オブ マテリアル) を使用してフィブロネクチンマイクロパターンから選択されます (図 3)。セルピッカーは、ソフトウェア23 を使用して電動ステージを制御します(図3A)。70 μmのガラスマイクロキャピラリー(図3B)を使用して、パターン化された新生児ラットCMを選んで注入します。細胞ピッカーは、真空を発生させ、圧力を加えることによって細胞を注入することによって、接着細胞をソートする。シリンジ番号1の真空は、シリンジポンプを使用してシリンジを引っ張ることによって適用される(図3C)。静水圧は重力に基づいており、顕微鏡デスクの上に87cmの距離に注射器番号2を置くことによって誘導されます。シリンジ1および2は、それぞれPTFEチューブを介して接続され、制御ユニットに埋め込まれているバルブ1と2に接続されている(図3D)。PTFE管はRNase自由水で完全に満ちている。次いで、選んだ単一細胞をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブに注入し、3.55μLのリシスバッファーを含む。 72時間の培養期間の後、古い媒体を取り除き、チップ表面を温かいDPBS-/-で静かに洗い流します。 皿を平らに保ち、皿の片側から1000 μLのピペットで古い媒体を優しく吸引します。チップが常に濡れたままであることを確認してください。 2 mLのDPBSを追加 -/- 穏やかに、パターン化された細胞に取り付けられている死んだ細胞のほとんどをドロップワイズで取り外し、チップの中心からその側面に移動します。 DPBSの大部分を吸引して、切り離された浮遊細胞をできるだけ多く取り除き、チップの中心から始めて側面に移動する。 ステップ 5.1.2 と 5.1.3 をもう一度繰り返します。 チップの端をつかむために斜め鉗子を使用し、すぐに新しい滅菌35ミリメートルグライナーペトリ皿に移して、選んでいる間に浮遊細胞の数を減らします。 すぐに1.5 mLのDPBS-/- を加え、チップが乾燥しないようにします。 1.5 μLの鮮やかな色素サイクルグリーンを加えて、生細胞の核を可視化します。 鉗子の先端を使用して、グライナーペトリ皿の中央にチップを置きます。 チップの上にチャンバー(材料のテーブル)を置きます。チャンバーは、細胞パターンへのアクセスをブロックすることなく、皿の底にチップを固定します。 グライナーペトリ皿をセルピッカーステージの皿ホルダーに取り付け、マグネットキャップを挿入します。 自動注入を調整します。 ライブビューウィンドウの画像の中央にある電動ステージに刻まれた十字線を探します。 十字線に焦点を合わせ、[スキャンと並べ替え] ウィンドウで[自動注入用の調整] ボタンを選択します。 DPBS-/- を DPBS/トリプシンの 1.5 mL に置き換えて-/- (1:1) 皿がステージ上にある間に、フィブロネクチンから細胞を緩めて、液体真空を使用して細胞を選ぶことができます。 [スキャンと並べ替え] ウィンドウの [スキャン] タブを使用して、チップ全体をスキャンします。視野内のチップの左上隅を見つけ、左上隅の列の現在の顕微鏡の位置をクリックします。 次に、電動ステージをチップの右下隅に移動します。顕微鏡をフォーカスし、右下隅の現在の 顕微鏡位置 をクリックします。 [ 最も鮮明な平面を設定 ]ボタンをクリックし、ポップアップウィンドウで 右上角に移動をクリックします。顕微鏡をフォーカスし 、左下隅に移動 をクリックして、フォーカスを設定します。完了したら 、[完了 ]ボタンをクリックして、スキャンを開始します。 スキャンが終了したら、[ 分析 ]タブに移動し、スタディ条件を満たす単一のセルを選択します。 ガラスのマイクロキャピラリーが顕微鏡のライブビューの真ん中に入っていることを確認します。 ソフトウェアのポンプウィンドウを使用して、シリンジ ポンプ を制御します。直径27mmの50mL番号1シリンジから4mLを引き出して真空を作ります。 [ 並べ替え ] タブ バルブの射出パラメータを設定します。選択した単一のセルを送出した注入量は1μlであり、バルブ2が120ミリ秒間開かれ、次いでバルブ1が200ミリ秒開いた場合、200ミリ秒の時間経過後にミリ秒であったと計算された。管の弾性のために、開弁1は流れを注入するのを止める。 バルブのピックアップパラメータを設定します。バルブ1が20ミリ秒間開かれ、その後バルブ2が10ミリ秒間開かれた場合、10ミリ秒のタイムラプスの後、ほとんどのパターン化された細胞を拾い上げることができると計算された。これは、トリプシンによって処理された後にフィブロネクチン結合が緩んだためです。 [パスの 計算 ] ボタンをクリックします。ソフトウェアは、選択したセルをピックアップし、チップ全体に注入するために、セルからセルへの最速パスを計算します。 顕微鏡をチップ表面のパターン化されたセルに焦点を合わせます。 ジョイスティックを使用して、微小キャピラリーを慎重に下に移動し、細胞に触れることなく微小毛柱の先端の最も鮮明な画像を得ることができるようにします。 マイクロピペットオフセットセクションの「設定」ボタンをクリックします。新しいウィンドウがポップアップし、マイクロキャピラリー断面が表示されます。毛細血管の正確な中心をクリックします。その後、ソフトウェアは、キャピラリーの先端オフセットを x、y、z 座標に記録します。 [並べ替えの開始] ボタンを使用して 並べ替えを起動 します。