نهج لدراسة النسخ المعتمدة على الشكل على مستوى خلية واحدة
Summary
تعرض هذه الورقة طرقًا لنمو الخلايا القلبية ذات الأشكال المختلفة ، والتي تمثل أمراضًا مختلفة ، وفرز هذه الخلايا القلبية المؤمنة استنادًا إلى مورفولوجياها على مستوى خلية واحدة. توفر المنصة المقترحة نهجًا جديدًا في الإنتاجية العالية وفحص الأدوية لأنواع مختلفة من قصور القلب.
Abstract
وقد ارتبطت أنواع مختلفة من تضخم القلب مع زيادة حجم myocytes القلب (CMs), جنبا إلى جنب مع التغيرات في مورفولوجيا CM. في حين أن آثار حجم الخلية على التعبير الجيني معروفة جيدا، فإن آثار شكل الخلية ليست مفهومة جيدا. تصف هذه الورقة طريقة تم تصميمها لتحليل تأثيرات مورفولوجيا CM على التعبير الجيني بشكل منهجي. وهو تفاصيل تطوير استراتيجية جديدة لملاءمة الخلية الواحدة التي يتبعها بعد ذلك تسلسل مرنا أحادي الخلية. كما تم تصميم رقاقة صغيرة ، والتي تحتوي على 3000 مستطيلة الشكل micropatterns الليفية. وهذا يجعل من الممكن أن تنمو CMs في طول واضح: عرض نسب العرض إلى الارتفاع (AR)، المقابلة لأنواع مختلفة من فشل القلب (HF). كما تصف الورقة بروتوكولًا تم تصميمه لالتقاط الخلايا الفردية من نمطها ، باستخدام منتقي الخلايا الصغيرة شبه المؤتمتة ، وحقنها بشكل فردي في مخزن منفصل للتحلل. وقد جعل هذا من الممكن لمحة transcriptomes من CMs واحد مع أنماط مورفوفيلية هندسية محددة وتوصيف لهم وفقا لمجموعة من الظروف العادية أو المرضية: اعتلال عضلة القلب الضخامي (HCM) أو ما بعد تحميل / متحدة المركز مقابل اعتلال عضلة القلب المتوسع (DCM) أو التحميل المسبق / غريب الأطوار. باختصار، تعرض هذه الورقة طرقًا لزراعة CMs ذات أشكال مختلفة، والتي تمثل أمراضًا مختلفة، وفرز هذه CMs الملتمَكة استنادًا إلى مورفولوجياها على مستوى خلية واحدة. ويوفر البرنامج المقترح نهجا جديدا في الإنتاجية العالية وفحص المخدرات لأنواع مختلفة من الترددات العالية.
Introduction
ووفقا لمنظمة الصحة العالمية، فإن أمراض القلب والأوعية الدموية هي أحد الأسباب الرئيسية للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم. يؤثر المرض القلبي الوعائي بشكل كبير على نوعية حياة الناس وله تأثير اجتماعي واقتصادي كبير. اعتلالات القلب، مثل الهدّان و DCM، هي اضطرابات أولية في عضلة القلب والأسباب الرئيسية ل HF ارتبطت بارتفاع معدلات المراضة والوفيات. هناك العديد من أسباب HF، بما في ذلك الآثار البيئية، مثل العدوى والتعرض للسموم أو بعض الأدوية8. HF يمكن أيضا أن يكون سببها الاستعداد الوراثي، وهي الطفرات9. ويعتقد أن التغيرات في التكوين الجيني التي تؤثر على المصفوفة خارج الخلية (ECM) جزيئات، integrins أو البروتينات الهيكلية الهيكلية يمكن أن تكون مسؤولة عن ضعف mechanosensation وأنواع مختلفة من أمراض القلب10.
السمة الرئيسية لHCM هو تضخم غير المبررة من البطين الأيسر11، وأحيانا من البطين الأيمن12، وهذا كثيرا ما يقدم مع المشاركة السائدة من الحاجز المتدخل. كما يتميز HCM بالخلل الانبساطي والفوضى والتليفالعضلي 13. في معظم الحالات، يتأثر الجهاز العقدي للقلب بالطفرات في البروتينات الساركية، مما يؤدي إلى زيادة قابلية التقلص من myocytes14. في المقابل، يتميز DCM بتمدد واحد، أو كليهما، البطينين ولديه مسببات الأسرة في 30٪ إلى 50٪ من الحالات15. يؤثر DCM على مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية ، مما يؤدي إلى ضعف تقلص الخلايا العضلية ، وموت الخلايا وإصلاح ليفي16.
وقد أظهرت علم الوراثة أن أنواع معينة من الطفرات قوة CMs واحدة لاعتماد خصائص شكل معين خلال HCM3، وهي الخلايا على شكل مربع مع طول : عرض AR الذي يساوي تقريبا 1:14 (AR1). وينطبق الشيء نفسه على DCM، مع خلايا ممدود مع AR الذي يساوي تقريبا 11:1 (AR11). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون سبب ارتفاع الترددات (مثل ارتفاع ضغط الدم). في هذه الحالات، مطالب الدم الديناميكية قوة CMs لاتخاذ على الأشكال المربعة، وفقا لقانون لابلاس، والتغييرات AR من 7:15 (AR7) إلى 1:16،7. ويمكن أن يكون سبب ارتفاع الحمولة العالية أيضاً زيادة في الحمولة المسبقة (مثلاً، في الظروف التي تؤدي إلى زيادة الحجم الزائد). عندما يحدث هذا، القيود الحيوية الفيزيائية تفرض CMs على الإطالة وتغييرات AR من 7:1 إلى 11:1.
يعتمد نشاط الإشارة في الأغشية على معلمات هندسة الخلايا العالمية، مثل AR الخلوية، والحجم، ومساحة سطح الغشاء وانحناء الغشاء18. عندما تم مطلية CMs الفئران حديثي الولادة على ركائز التي تم نقشها لتقييد الخلايا في طول محدد: عرض AR، أنها أظهرت أفضل وظيفة انكماش عندما كانت النسب مماثلة للخلايا في قلب الكبار صحية. في المقابل، كان أداؤها ضعيفا عندما كانت النسب مماثلة لتلك التي من myocytes في قلوب الفشل19. في المراحل المبكرة من تضخم، تصبح الخلايا أوسع، كما يتجلى في زيادة في منطقة المقطع. يحدث HF في المراحل اللاحقة من تضخم والخلايا تظهر عادة ممدود. ولذلك، فإنه ليس من المستغرب أن في نماذج الفئران الحية من تضخم مزمن قد أبلغت عن زيادة في طول myocyte البطين الأيسر من حوالي 30٪20، ولكن الكبار CMs من نموذج الفأر المعدلة وراثيا التي تم علاجها بشكل حاد مع المحفزات الضخامي في المختبر أظهرت زيادات مماثلة في عرض الخلية بدلا من21.
تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، والذي يسمح بتحليل دقيق لنسخ الخلايا الفردية ، يحدث حاليًا ثورة في فهم بيولوجيا الخلايا. كانت هذه التقنية هي الطريقة المفضلة عندما يتعلق الأمر بالإجابة على السؤال عن كيفية تأثير أشكال الخلايا الفردية على التعبير الجيني. قارنا الخلايا الفردية ذات الأشكال المختلفة، خاصة مع ARs من 1:1، 7:1 أو 11:1. وقد تم ذلك عن طريق بذر CMS البطين الفئران حديثي الولادة على رقاقة مصممة خصيصا مليئة micropatterns الليفية المغلفة2 مع ARs محددة من 1:1، 7:1 أو 11:1. تم تصنيع micropatterns باستخدام تكنولوجيا الطباعة الضوئية. كانت مطلية micropatterns بواسطة فيبرومينيكتان ، وتحيط بها سطح السيتوبوب. ولذلك، سوف CMs إرفاق، وانتشار والتقاط AR المحدد من micropatterns فقط من خلال النمو على الركيزة الليفية، مع تجنب المنطقة السيتوبوب. لا توجد الـ micropatterns في شكل جيد. بدلا من ذلك، ومستوى فيبرومينكتين هو بالضبط في نفس الارتفاع من المنطقة السيتوبوب المحيطة. هذا توفير ظروف مماثلة لتنامي الخلايا في طبق بيتري، كما لا يوجد أي إجهاد من الجدران المحيطة بها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مساحة السطح من micropatterns مع ARs مختلفة متساوية.
كان هناك جانبان مهمان بشكل خاص من التصميم التجريبي ، مما أدى إلى استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية بدلاً من تسلسل الحمض النووي الريبي السائب. أولاً، يمكن شغل نسب قليلة فقط من الterns الصغيرة بواسطة خلية واحدة. ثانياً، في بعض الأحيان لا تشغل خلية واحدة سطح micropattern بشكل كامل. يجب اختيار الخلايا الفردية التي تغطي سطح micropattern بشكل كامل لتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. لأن مجموعة فرعية فقط من الخلايا مطلي على رقاقة راض عن كلا المعيارين، لم يكن من الممكن ببساطة لـ trypsinize رقاقة كاملة وجمع جميع الخلايا لتسلسل RNA السائبة. تحتاج الخلايا المؤهلة إلى أن يتم انتقاؤها بشكل فردي باستخدام منتقي الخلايا شبه المؤتمتة.
لا يزال من غير المعروف حاليا ما إذا كان شكل CM، في حد ذاته، له تأثير داخل وظيفية على التزامنية عضلة القلب. وكان الغرض الرئيسي من الأساليب المقترحة في هذه الورقة لتطوير منصة جديدة لدراسة ما إذا كان شكل الخلية في حدّها كان له تأثير على نسخة17. على الرغم من أن الدراسات في المختبر يختلف عن الدراسات في الجسم الحي، كان الغرض من هذه الدراسة للتحقيق في تأثير أشكال الخلايا المختلفة على التعبير الجيني، مع الأخذ في الاعتبار أن مقارنة الخلايا ذات الأشكال المختلفة في الجسم الحي هو طالب للغاية. وقد استلهمت هذه التجارب من Kuo وآخرون19، الذين استخدموا نهجا مماثلا وأفادوا بأنهم لاحظوا تغيرات في المعلمات الفسيولوجية بسبب التغيرات في شكل الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدمت هذه الدراسة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، وهي تقنية جديدة وقوية يمكنها اكتشاف نسخة الخلايا الفردية. وقد اقترن بنهج مبتكر في زراعة تدابير البرمجة المشتركة الوحيدة، بحيث أنها أخذت على مختلف المفاعلات ARs التي، خلاف ذلك، كان يمكن أن يكون فقط لوحظ في الجسم الحي.
وكان للدراسة بعض القيود. على سبيل المثال، كان يجب استخدام CMs الوليدي لإنشاء أنواع مختلفة من المورفولوجيين، لأنها تشكل تحديًا استثنائيًا للثقافة بما يكفي من CMs الحيوية للبالغين لمدة 72 ساعة في أشكال محددة. وعلاوة على ذلك، تم استزراع CMs لمدة 72 ساعة السابقين vivo، والتي قد يكون لها تأثير على نمط التعبير الجيني. ومع ذلك ، كان هذا الزرع ضروريًا ، بحيث يمكن للخلايا أن تشكل أنواعًا محددة من المورفو. وعلاوة على ذلك، تم اختيار الخلايا الوحيدة التي كانت أحادية النواة وتغطي بالكامل micropattern الليفية للفرز. يجب فرز الخلايا المنقوشة على كل رقاقة فقط في جولة واحدة من الفرز. وأخيراً، تم التقاط حوالي 50 خلية تبلغ حوالي ثلث الخلايا المختارة بنجاح من كل رقاقة. هناك سببان تقييد عدد الخلايا التي تم انتقاؤها بنجاح. أولاً، كانت بعض الخلايا متصلة بإحكام بنمط الليفي ولم يكن تدفق البيك آب قسريًا بما يكفي لالتقاطها بنجاح. ثانيا، بسبب العلاج التربسين، أصبح المرفق بين بعض الخلايا وليفية فضفاضة جدا. وبالتالي، تم دفع هذه الخلايا بعيدا عن micropatterns فينينيكتين، عندما اقترب من الكابيليا الدقيقة لهم، وأنها لم يتم التقاطها. المؤلف لا يدعي أن هذا الإعداد هو نفسه في بيئة الجسم الحي ، لكنه ثبت أن يكون نهجا قابلا للتطبيق للإجابة على السؤال البحثي.
والطريقة المقترحة قابلة للتطبيق على أنواع مختلفة من الخلايا (على سبيل المثال، بالنسبة لـ hiPS-CMs). ومع ذلك، يجب أن يكون الأمثل العوامل التالية لدراسة أنواع الخلايا الأخرى. وينبغي استخدام جزيئات لاصقة مناسبة ECM للتعلق من نوع الخلية محددة لطلاء micropatterns. وينبغي تعديل هندسة micropatterns وفقا لمسألة الدراسة ونوع الخلية. يمكن تعديل فترة الاستزراع بناءً على سؤال الدراسة. يجب تحسين مفرزة وحضانة الوقت بدقة لخلية الدراسة. على سبيل المثال، Accutase يمكن استخدامها بدلا من TryplE فصاخلة الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا العصبية. وينبغي فحص المعلمات وقت الافتتاح للصمامات لاختيار الخلايا بنجاح، ولكن بلطف. باختصار، قمنا بتصميم منصة جديدة لدراسة شكل الخلايا التي يمكن أن توفر موردا قيما للباحثين في هذا المجال. في هذا السياق ، قمنا بتصميم نهج تجريبي يحاكي الأشكال المميزة في المختبرات المفروضة على CM في الجسم الحي من القيود الديناميكية الدموية لتحديد التفاعل بين العمارة الخلوية والتعبير الجيني. كما نبلغ عن تطوير منصة جديدة لدراسة HF في المختبر وتحديد شكل الخلايا كمحدد قوي للتعبير الجيني. هذه ملاحظة جديدة ذات آثار بعيدة المدى على علم الأحياء والطب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis analyzer |
| Anti-Red Blood Cell MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-109-681 | |
| Axio Observer microscope | Zeiss | Z1 | Inverted microscope |
| Betaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich, MERCK | B0300 | |
| CellSorter | CELLSORTER | https://www.singlecellpicker.com/ | Cell picker |
| CYTOOchamber | CYTOO | 30-010 | Custom-designed chip |
| CYTOOchip | CYTOO | 10-950-00-18 | Chamber |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31966-021 | high glucose, GlutaMAX Supplement |
| dNTP mix (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R1122 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Abcam PLC | ab150105 | |
| DTT (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich, MERCK | F4759 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Rotor-cap tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | Dissociator with heater |
| Greiner CELLSTAR Petri dish | Sigma-Aldrich, MERCK | P6987 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich, MERCK | H0146 | |
| LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 31150-022 | |
| NE-1000 syringe pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | Syringe pump |
| Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, rat | Miltenyi Biotec | 130-105-420 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-098-373 | |
| Oligo-dT30VN oligonucleotides | IDT Technology | 5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′ | |
| RNAse inhibitor (40 U µL-1) | Clontech | 2313A | |
| sarcomeric α-actinin | Sigma-Aldrich, MERCK | EA-53 | |
| SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 | Confocal microscope |
| Superscript II first-strand buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| Superscript II reverse transcriptase (200 U µL-1) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, MERCK | T9284 | |
| TryplE Express enzyme, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| TSO (100 µM) | QIAGEN | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′ | |
| Vibrant Dye Cycle green | Thermo Fisher Scientific | V35004 |
References
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (8), 589-600 (2006).
- Haftbaradaran Esfahani, P., et al. Cell shape determines gene expression: cardiomyocyte morphotypic transcriptomes. Basic Research in Cardiology. 115 (1), 7 (2019).
- Kontrogianni-Konstantopoulos, A., Benian, G., Granzier, H. Advances in Muscle Physiology and Pathophysiology 2011. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 930836 (2012).
- Hill, J. A., Olson, E. N. Cardiac plasticity. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).
- Bray, M. A., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Sarcomere alignment is regulated by myocyte shape. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (8), 641-651 (2008).
- Benjamin, I. J., Schneider, M. D. Learning from failure: congestive heart failure in the postgenomic age. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 495-499 (2005).
- Opie, L. H., Commerford, P. J., Gersh, B. J., Pfeffer, M. A. Controversies in ventricular remodelling. Lancet. 367 (9507), 356-367 (2006).
- Braunwald, E. Cardiomyopathies: An Overview. Circulation Research. 121 (7), 711-721 (2017).
- Knoll, R., et al. The cardiac mechanical stretch sensor machinery involves a Z disc complex that is defective in a subset of human dilated cardiomyopathy. Cell. 111 (7), 943-955 (2002).
- Frangogiannis, N. G. The Extracellular Matrix in Ischemic and Nonischemic Heart Failure. Circulation Research. 125 (1), 117-146 (2019).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic Cardiomyopathy: Genetics, Pathogenesis, Clinical Manifestations, Diagnosis, and Therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Mozaffarian, D., Caldwell, J. H. Right ventricular involvement in hypertrophic cardiomyopathy: a case report and literature review. Clinical Cardiology. 24 (1), 2-8 (2001).
- Olsson, M. C., Palmer, B. M., Stauffer, B. L., Leinwand, L. A., Moore, R. L. Morphological and functional alterations in ventricular myocytes from male transgenic mice with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Research. 94 (2), 201-207 (2004).
- Toepfer, C. N., et al. Hypertrophic cardiomyopathy mutations in MYBPC3 dysregulate myosin. Science Translational Medicine. 11 (476), (2019).
- McKenna, W. J., Maron, B. J., Thiene, G. Classification, Epidemiology, and Global Burden of Cardiomyopathies. Circulation Research. 121 (7), 722-730 (2017).
- Schultheiss, H. P., et al. Dilated cardiomyopathy. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 32 (2019).
- Knoll, R. A role for membrane shape and information processing in cardiac physiology. Pflugers Arch. 467 (1), 167-173 (2015).
- Rangamani, P., et al. Decoding information in cell shape. Cell. 154 (6), 1356-1369 (2013).
- Kuo, P. L., et al. Myocyte shape regulates lateral registry of sarcomeres and contractility. American Journal of Pathology. 181 (6), 2030-2037 (2012).
- Gerdes, A. M., Onodera, T., Wang, X., McCune, S. A. Myocyte remodeling during the progression to failure in rats with hypertension. Hypertension. 28 (4), 609-614 (1996).
- Kehat, I., et al. Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 regulate the balance between eccentric and concentric cardiac growth. Circulation Research. 108 (2), 176-183 (2011).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- Kornyei, Z., et al. Cell sorting in a Petri dish controlled by computer vision. Scientific Reports. 3, 1088 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. The interdependence of membrane shape and cellular signal processing. Cell. 156 (6), 1132-1138 (2014).
