ŞekilBağımlı Transkripsiyonları Tek Hücre Düzeyinde Çalışma Yaklaşımı

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, İsveç’in Stockholm’deki Karolinska Enstitüsü hayvan etik komitesinin yönetmeliklerine uygundu. 1. Mikro desenli talaş düzeni Borosilikat camüzerine fotolitografi ile basılmış, aktif mikrodesenli 19,5 mm x 19,5 mm’lik bir kapak fişidir.NOT: Bu mikro desenler sitofobik bir alanla çevrilidir. Bu nedenle, bir tohumlu hücre sadece bu mikro desenlerden birine bağlanabilir ve büyüyebilir ve bu mikro desenin AR’ını yakalayabilir. Çip üç bölgeye ayrılır ve her bölge belirli bir AR ile mikro desenleroluşur. Fiş düzeni Şekil 1B’degösterilmiştir. Tanımlanan AR’lerin geometrisi Tablo 1’desunulmuştur. Fibronektin mikro desenlerinin farklı şekillerinin büyütülmüş floresan görüntüleri Şekil 1B’dekialt görüntülerde gösterilmiştir. 2. Kaplama mikro desenli yongaları Her talaş için 2 mL fosfat tamponlu saline 80 μg fibronektin ekleyerek 2x kaplama protein çözeltisi hazırlayın (PBS-/-). Bir çipi 35 mm’lik Greiner Petri kabına aktarın ve hemen 2 mL PBSekleyin -/-. Daha sonra 2x kaplama protein çözeltisinin 2 mL’sini ekleyin. 2 saat oda sıcaklığında cips kuluçka. Kaplama çözeltisini art arda seyreltme adımlarıyla PBS-/-ile yıkayın. Talaş yüzeyi her zaman ıslak olmalıdır. Daha sonra PBS’yi 2 mL kaplama orta sı ve inkübünle 37 °C’de tohumlama hücrelerine kadar değiştirin. 3. CM’lerin İzolasyon DMEM:M199 (4:1) at serumu, %4 fetal sığır serumu, %2 HEPES (1 M) ve %1 penisilin/streptomisin (10.000 U/mL)22ile kaplama ortamını hazırlayın. 2 günlük yenidoğan sıçan kalplerinin sol ventrikülünden dokuyu inceleyin ve PBS içeren 10 cm’lik bir tabağa aktarın. Yaklaşık 1 mm3 adet doku kesin. Hasat edilen dokuyu, doku dissosiyamı için kapakta bir rotor la donatılmış bir rotor-kapak tüpüne aktarın(Malzeme Tablosu). Doku yerleşmek ve daha sonra dikkatle supernatant çıkarın. Neonatal Kalp Ayrıştırma Kiti(Malzeme Tablosu)kullanılarak hazırlanan 1 ve 2 enzim karışımının 2,5 mL’sini C Tüpüne ekleyin ve kapağı sıkıca kapatın. Rotor-kapak tüpünü ısıtıcılarla donatılmış dissosiyatörün koluna takın (Şekil 2A veB) ( MalzemeTablosu). Yaklaşık bir saat süren kuluçka programını(Şekil 2C)37C_mr_NHDK_1 çalıştırın. Kuluçka programı çalışırken PBS,pH 7.2’de 2 mM EDTA ve %0.5 büyükbaş serum albumin (BSA) içeren PEB tamponunu hazırlayın ve 4 °C’de tutun. Kuluçka programı sona erdikten sonra rotor-kapak tüpünü(Şekil 2D)ayırın ve önceden ısıtılmış kaplama ortamından 7,5 mL ekleyin. Numuneyi yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonuna 70 μm’lik bir süzgeç kullanarak filtre uygulayın. Süzgeci 3 mL daha kaplama aracıyla yıkayın. 5 dakika için 600 x g hücre süspansiyon santrifüj. Supernatant’ı tamamen aspire edin. Hücre peletini 60 μL soğuk PEB tamponunda yeniden askıya alın. 20 μL Neonatal Kardiyomiyosit İzolasyon Kokteyli(Malzeme Tablosu),mikron boyutlu boncuklar içeren ve CM’siz leri hedef alın. Anti-Kırmızı Kan Hücresi boncuk 20 μL ekleyin (Malzeme Tablosu). Süspansiyonu karıştırın ve 4 °C’de 15 dakika kuluçkaya yatırın. 400 μL PEB arabellek ekleyin. Hücre süspansiyonunu, mıknatıslı bir standa dikey olarak yerleştirilen ve PEB tamponu yla iyi yıkanan LD sütununa(Malzeme Tablosu)uygulayın. Etiketlenmemiş hücreleri toplayın ve 0,5 mL PEB arabelleği içeren sütunu yıkayın. 8 mL kaplama ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonuna 75cm’lik 2 kaplamasız kültür şişesine aktarın ve 37 °C’de 1,5 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Kalan non-CM’ler kaplamasız hücre kültürüne uymaya başlayacak ve hücre süspansiyonu CM popülasyonu tarafından zenginleştirilmiş olacaktır. 4. Desenleme CM’leri NOT: Tek CM’leri 1:1, 7:1 veya 11:1’lik AR’larla karşılaştırdık. Bu, izole neonatal sıçan CM’lerinin 1:1, 7:1 veya 11:1 tanımlı ar’larla fibronektin kaplı mikro desenlerle dolu özel olarak tasarlanmış bir çipe tohumlanmasıyla yapılır. Mikro desenler fibronektin ile kaplandı, sitofobik yüzeyle çevriliydi. Bu nedenle, CM’ler sadece fibronektin substrat üzerinde büyüyerek mikro desenlerin tanımlanan AR’ını takacak, yayacak ve yakalayacak. İzole CM’leri aşağıdaki adımlara göre desenle. Hücre süspansiyonuna 15 mL’lik bir tüp aktarın, hücreleri sayın ve uygun kaplama ortamı ekleyerek mL başına 100.000 hücre konsantrasyonuna seyreltin. 35 mm’lik Greiner Petri kabının içine 2 mL sıcak kaplama ortamına batırılmış olan çipe 2 mL hücre süspansiyonu ekleyin. CM’lerin fibronektin kaplı mikro desenlere bağlanmasına izin vermek ve her CM’nin substrat mikrodemasını elde etmesini sağlamak için yemeği %5 CO2 ile 37 °C’de kuluçkaya yatırın. Saat 18’den sonra çipi kontrol et. Hücrelerin çoğu bağlıysa, desenli hücreye bağlı olan enkaz ve ölü hücreleri ayırın ve çıkarın. Bunu, kaplama ortamını çıkararak ve çipin merkezinden başlayarak pbs-/- damla gibi ekleyerek ve sonra yanlara doğru hareket ederek yapın. 2 kez tekrarlayın. DMEM:M199 (4:1) %4 at serumu, %4 fetal sığır serumu, %2 HEPES (1 M) ve %1 penisilin/streptomisin (10.000 U/mL) ile taze bakım ortamı ile PBS’yi aspire edin. 5. Yapıştırma CM’leri çekme NOT: 72 saatlik bir kültürlenme süresinden sonra, desenli tek CM’ler fibronektin mikro desenlerinden yarı otomatik hücre toplayıcısı(Malzeme Tablosu)kullanılarak seçilir (Şekil 3). Hücre seçici motorlu sahne(Şekil 3A)kontrol etmek için bir yazılım23 kullanır. 70 μm cam mikrocapiller(Şekil 3B)desenli yenidoğan sıçan CM’lerini almak ve enjekte etmek için kullanılır. Hücre seçici bir vakum üreten ve basınç uygulayarak hücreleri enjekte ederek yapışık hücreleri sıralar. 1 numaralı şırıngadaki vakum şırınga pompası kullanılarak çekilerek uygulanır (Şekil 3C). Hidrostatik basınç yerçekimine dayanır ve mikroskop masasının üzerine 87 cm mesafede şırınga sayısı 2 yerleştirilerek indüklenir. Şırıngalar 1 ve 2 sırasıyla PTFE tüpleri ile kontrol ünitesine gömülü olan 1 ve 2 numaralı vanalara bağlanır(Şekil 3D). PTFE tüpleri tamamen RNase içermeyen su ile doldurulur. Daha sonra toplanan tek hücre, 3.55 l likiz tamponu içeren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpüne enjekte edilir. 72 saatlik bir kültür den sonra, eski ortamı çıkarın ve talaş yüzeyini ılık DPBS-/-ile hafifçe yıkayın. Çanak düz tutun ve yemeğin bir tarafında 1000 μL pipet ile yavaşça eski orta aspire. Çipin her zaman ıslak kaldığından emin olun. 2 mL DPBSekleyin -/- yavaşça ve damla-bilge desenli hücrelere bağlı ölü hücrelerin çoğu ayırmak, çipin merkezinden başlayarak ve daha sonra kenarlarına hareket. DpBS’nin çoğunu, çipin merkezinden başlayıp kenarlara doğru hareket ederek mümkün olduğunca çok sayıda bağımsız kayan hücreyi çıkarmak için aspire edin. 5.1.2 ve 5.1.3 adımlarını bir kez daha tekrarlayın. TalaşKenarını kapmak için açılı çalgıları kullanın ve toplarken yüzen hücrelerin sayısını azaltmak için hemen yeni bir steril 35 mm Greiner Petri kabına aktarın. Talaşın kuruması için hemen 1,5 mL DPBS-/- ekleyin. Canlı hücrelerin çekirdeklerini görselleştirmek için 1,5 l Canlı Boya Döngüsü yeşili ekleyin. Talaşucunu kullanarak çipi Greiner Petri kabının ortasına yerleştirin. Çipin üzerine bir hazne(Malzeme Tablosu)koyun. Oda, hücre desenlerine erişimi engellemeden çipi yemeğin dibine sabitleyecek. Greiner Petri kabını hücre toplayıcı aşamasının kabının üzerine monte edin ve manyetik kapağı yerleştirin. Otomatik enjeksiyonu kalibre edin. Live View penceresinde görüntünün ortasındaki motorlu sahneye kazınmış olan artı işaretini bulun. Artı işaretine odaklanın ve Tarama ve sıralama penceresinde otomatik enjeksiyon düğmesi için Kalibrasyon’u seçin. DPBS-/- 1.5 mL DPBS/tripsin-/- (1:1) ile değiştirin, böylece hücreleri almak için sıvı bir vakum kullanılabilir fibronektin hücreleri gevşetin. Tarama ve sıralama penceresindeki Tarama sekmesini kullanarak tüm çipi tarayıp taramayı. Çipin sol üst köşesini görüş alanında bulun ve sol üst köşe satırındaki geçerli mikroskop pozisyonunu al’a tıklayın. Daha sonra, motorlu sahneyi çipin sağ alt köşesine taşıyın. Mikroskobu odaklayın ve sağ alt köşe satırında geçerli mikroskop pozisyonunu al’a tıklayın. En keskin düzlemi ayarla düğmesine ve açılan pencereye tıklayın sağ üst köşeye git’etıklayın. Mikroskobu odaklayın ve sol alt köşeye git’e tıklayın ve odağı ayarlayın. Bittiğinde Bitir düğmesini tıklatın ve tarama başlatın. Tarama sonlandırıldığında, Çözümleme sekmesine gidin ve çalışma ölçütlerini geçen tek hücreleri seçin. Cam mikrokapillerin mikroskobun canlı görüntüsünün ortasında olduğundan emin olun. Yazılımın Pompa penceresini kullanarak şırınga pompasını kontrol edin. Çapı 27 mm olan 50 mL’lik 1 şırıngadan 4 mL çekerek bir vakum oluşturun. Sıralama sekmesinde Vanaların enjeksiyon parametrelerini ayarlayın. Tek bir hücreyi teslim eden enjeksiyon hacminin 1 μl olduğu, eğer valf 2’nin 120 milisaniye, valf 1’in 200 milisaniyelik bir zaman atlamadan sonra 20 saniye açıldığı hesaplanmıştır. Tüplerin elastikiyeti nedeniyle, açık vana 1 akışı enjekte durdurmak için. Vanaların pick-up parametrelerini ayarlayın. Eğer valf 1 20 milisaniye ve sonra valf 2 10 milisaniye, 10 milisaniye lik bir zaman atlamadan sonra açılırsa, desenli hücrelerin çoğunun alınabileceği hesaplanmıştır. Bunun nedeni, fibronektin ciltlerinin tripsin ile tedavi edildikten sonra gevşetilmiş olmasıdır. Yolu Hesapla düğmesine tıklayın. Yazılım, seçilen hücreleri çip boyunca toplamak ve enjekte etmek için hücreden hücreye en hızlı yolu oluşturur. Mikroskobu çip yüzeyindeki desenli bir hücreye odakla. Joystick kullanarak, mikrokapiller dikkatle aşağı hareket ettirin, böylece mikrokapillerucun ucunun en keskin görüntüsü hücreye dokunmadan elde edilebilir. Micropipette ofset bölümündeki Set düğmesini tıklatın. Mikrokapiller kesiti gösteren yeni bir pencere açılır. Kılcal damarın tam merkezine tıklayın. Yazılım daha sonra x, y ve z koordinatlarında kılcal uç ofset kaydeder. Başlat sıralama düğmesini kullanarak sıralamayı başlatın.