Подход к изучению зависимых от форм транскриптомики на уровне одной клетки
Summary
В этой работе представлены методы выращивания сердечных миоцитов с различными формами, которые представляют различные патологии, и сортировки этих адептов сердечных миоцитов на основе их морфологии на уровне одной клетки. Предлагаемая платформа обеспечивает новый подход к высокой пропускной способности и скрининга наркотиков для различных типов сердечной недостаточности.
Abstract
Различные типы сердечной гипертрофии были связаны с увеличением объема сердечных миоцитов (CMs), наряду с изменениями в морфологии CM. Хотя влияние объема клеток на экспрессию генов хорошо известно, эффекты формы клеток не очень хорошо изучены. В этой статье описывается метод, который был разработан для систематического анализа влияния морфологии СМ на экспрессию генов. В нем подробно рассказывается о разработке новой стратегии одноклеточного захвата, за которой следует одноклеточное секвенирование мРНК. Также был разработан микропаттернированный чип, содержащий 3000 прямоугольных фибронектиновых микропаттернов. Это позволяет выращивать СМ в разной длине: коэффициенты ширины (AR), соответствующие различным типам сердечной недостаточности (HF). В документе также описывается протокол, который был разработан, чтобы забрать одиночные клетки из их шаблона, используя полуавтоматический микро-пипеттинг сборщик клеток, и индивидуально вводить их в отдельный буфер лиза. Это сделало возможным профилировать транскриптомы отдельных СМ с определенными геометрическими морфотипами и характеризовать их в соответствии с рядом нормальных или патологических состояний: гипертрофической кардиомиопатии (HCM) или после нагрузки /концентрической против расширенной кардиомиопатии (DCM) или предустановки / эксцентричной. Таким образом, в настоящем документе представлены методы выращивания CMs с различными формами, которые представляют различные патологии, и сортировки этих приверженцев CMs на основе их морфологии на одноклеточном уровне. Предлагаемая платформа обеспечивает новый подход к высокой пропускной способности и скрининга наркотиков для различных типов HF.
Introduction
По данным Всемирной организации здравоохранения, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. ССЗ резко влияет на качество жизни людей и оказывает огромное социально-экономическое воздействие. Кардиомиопатия, такие как HCM и DCM, являются основными нарушениями сердечной мышцы и основные причины HF были связаны с высокой заболеваемостью и смертностью. Есть много причин HF, в том числе воздействие на окружающую среду, такие как инфекции и воздействие токсинов или некоторыхпрепаратов 8. HF также может быть вызвано генетической предрасположенностью, а именно мутациями9. Считается, что изменения в генетическом составе, которые влияют на внеклеточную матрицу (ECM) молекулы, интегрины или цитоскелетные белки могут быть ответственны за нарушение механосенсации и различных типов сердечных заболеваний10.
Главной особенностью HCM является необъяснимая гипертрофиялевого желудочка 11, а иногда и правого желудочка12, и это часто представляет с преобладающим участием промежуточной перегородки. HCM также характеризуется диастолической дисфункции и миоцитов беспорядок и фиброз13. В большинстве случаев на контрактильный аппарат сердца влияют мутации в саркомерных белках, что приводит к увеличению контрактности миоцитов14. В отличие от этого, DCM характеризуется дилатации одного, или обоих, желудочков и имеет семейную этиологию в 30% до 50% случаев15. DCM влияет на широкий спектр клеточных функций, что приводит к нарушению сокращения миоцитов, гибели клеток и фиброзногоремонта 16.
Генетика показала, что некоторые типы мутаций заставляют отдельных CMs принимать конкретные характеристики формы во время HCM3,а именно квадратной формы клеток с длиной: ширина AR, что почти равно 1:14 (AR1). То же самое относится и к DCM, с удлиненными клетками с AR, что почти равно 11:1 (AR11). Кроме того, HF может быть вызван увеличением после нагрузки (например, при гипертонии). В этих случаях гемодинамические требования заставляют CMs принимать квадратные формы, в соответствии с законом Лапласа, и AR меняется с 7:15 (AR7) до 1:16,7. HF также может быть вызван увеличением предустановки (например, в условиях, которые приводят к перегрузке объема). Когда это происходит, биофизические ограничения заставляют CMs удлиняться и AR меняется от 7:1 до 11:1.
Сигнальная активность мембран зависит от глобальных параметров геометрии клеток, таких как клеточный АР, размер, площадь поверхности мембраны и кривизнамембраны 18. Когда неонатальные крысы CMs были поцараны на субстратах, которые были узорчаты, чтобы ограничить клетки в определенной длине: ширина AR, они продемонстрировали лучшую контрактильной функции, когда отношения были похожи на клетки в здоровом сердце взрослого человека. В отличие от них, они выполняются плохо, когда отношения были похожи на те из миоцитов в отсутствиисердца 19. На ранних стадиях гипертрофии клетки становятся шире, о чем свидетельствует увеличение поперечной области. HF происходит на более поздних стадиях гипертрофии и клетки обычно появляются удлиненные. Поэтому неудивительно, что в виво крысы модели хронической гипертрофии сообщили об увеличении длины левого желудочка миоцитов около 30%20, но взрослые CMs от трансгенной модели мыши, которые были остро обработаны с гипертрофическими стимулами in vitro продемонстрировали аналогичное увеличение шириныклеток вместо 21.
Одноклеточное секвенирование РНК, которое позволяет точное анализ транскриптома отдельных клеток, в настоящее время революционизирует понимание клеточной биологии. Эта технология была предпочтительным методом, когда дело дошло до ответа на вопрос о том, как отдельные формы клеток влияют на экспрессию генов. Мы сравнили одиночные клетки с различными формами, в частности с ARs 1:1, 7:1 или 11:1. Это было сделано путем посева неонатальной крысы желудочков CMs на специально разработанный чип заполнен фибронектин покрытием микропаттернов2 с определенными ARs 1:1, 7:1 или 11:1. Микропаттерны были изготовлены с использованием технологии фотолитографии. Микропаттерны были покрыты фибронектином, окруженным цитофобной поверхностью. Таким образом, CMs будет прикреплять, распространять и захватывать определенные AR микропаттернов, только растет на фибронектин субстрат, избегая при этом цитофобной области. Микропаттерны не в хорошо форме. Вместо этого уровень фибронектина находится точно на той же высоте окружающей цитофобной области. Это обеспечило аналогичные условия для выращивания клеток в чашке Петри, так как нет стресса от окружающих стен. Кроме того, площадь поверхности микропаттернов с различными АР равна.
Существует два особенно важных аспекта экспериментальной конструкции, которые привели к использованию одноклеточного секвенирования РНК вместо массового секвенирования РНК. Во-первых, только несколько процентов микропаттернов могут быть заняты одной ячейкой. Во-вторых, иногда одна ячейка не полностью занимает поверхность микропаттерна. Одиночные клетки, полностью покрываемые поверхностью микропаттерна, должны быть выбраны для анализа одноклеточной РНК. Поскольку только подгруппа поцатворенные клетки на чипе удовлетворяли обоим критериям, было невозможно просто попробовать промизинировать весь чип и собрать все клетки для массового секвенирования РНК. Квалифицированные ячейки необходимо выбрать индивидуально с помощью полуавтоматического сборщика клеток.
В настоящее время остается неизвестным, оказывает ли форма CM само по себе внутрифункциональное воздействие на миокарда syncytium. Основная цель методов, предложенных в настоящем документе, состояла в разработке новой платформы для изучения того, оказывает ли форма клеток как таковое влияние на транскриптом17. Хотя исследования in vitro отличаются от исследований in vivo, целью данного исследования было исследовать влияние различных форм клеток на экспрессию генов, имея в виду, что сравнение клеток с различными формами in vivo является чрезвычайно требовательным. Эти эксперименты были вдохновлены Kuo et al.19, который использовал аналогичный подход и сообщил, что они наблюдали изменения физиологических параметров из-за изменений в форме клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании использовалось одноклеточное секвенирование РНК, которое является новой и мощной технологией, которая может обнаружить транскриптом одиночных клеток. Он был объединен с новаторским подходом к культивированию отдельных CMs, так что они взяли на себя различные ARs, что, в противном случае, можно было бы наблюдать только in vivo.
Исследование имело некоторые ограничения. Например, неонатальные CMs должны были быть использованы для создания различных морфотипов, так как это исключительно сложной задачей для культуры достаточно жизненно важных взрослых CMs в течение 72 часов в определенных формах. Кроме того, CMs были культурны в течение 72 часов ex vivo, которые могли бы оказать влияние на модель экспрессии генов. Однако это культивирование было необходимо, чтобы клетки могли образовывать специфические морфотипы. Кроме того, для сортировки были отобраны только одиночные клетки, которые были мононуклеированы и полностью покрыты микропаттерном фибронектина. Узорчатые ячейки на каждом чипе должны быть отсортированы только в одном раунде сортировки. Наконец, около 50 ячеек, что составляет примерно одну треть выбранных ячеек были успешно подобраны из каждого чипа. Есть две причины, которые ограничили количество успешно подобранных ячеек. Во-первых, некоторые клетки были слишком плотно прикреплены к шаблону фибронектина, и поток пикапа не был достаточно нанравлив, чтобы успешно забрать их. Во-вторых, из-за лечения трипсина, привязанность между некоторыми клетками и фибронектин стал слишком свободным. Следовательно, эти клетки были отодвинуты от их микропаттернов фибронектина, когда микрокапильярии приблизились к ним, и они не были подобраны. Авторы не утверждают, что эта установка такая же, как среда in vivo, но она оказалась жизнеспособным подходом к ответу на исследовательский вопрос.
Предлагаемый метод применим к различным типам ячеей (например, для hiPS-CMs). Тем не менее, следующие факторы должны быть оптимизированы для изучения других типов клеток. Подходящие молекулы клея ECM для крепления определенного типа клеток должны использоваться для покрытия микропаттернов. Геометрия микропаттернов должна быть изменена в соответствии с вопросом исследования и типом клетки. Период культивирования может быть изменен на основе вопроса исследования. Реагент отряда и его инкубационое время должны быть оптимизированы именно для типа клетки исследования. Например, Accutase можно использовать вместо TryplE для отслоения эмбриональных и нейрональных стволовых клеток. Параметры времени открытия клапанов должны быть тщательно изучены, чтобы выбрать клетки успешно, но осторожно. Таким образом, мы разработали новую платформу для изучения формы клеток, которая может обеспечить ценный ресурс для исследователей в этой области. В этом контексте мы разработали экспериментальный подход, который имитировал характерные формы in vitro, наложенные на CM in vivo гемодинамическими ограничениями, чтобы определить взаимодействие между клеточной архитектурой и экспрессией генов. Мы также сообщаем о разработке новой платформы для изучения HF in vitro и идентификации формы клеток как мощного детерминанта экспрессии генов. Это новое наблюдение с далеко идущими последствиями для биологии и медицины.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ни один.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis analyzer |
| Anti-Red Blood Cell MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-109-681 | |
| Axio Observer microscope | Zeiss | Z1 | Inverted microscope |
| Betaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich, MERCK | B0300 | |
| CellSorter | CELLSORTER | https://www.singlecellpicker.com/ | Cell picker |
| CYTOOchamber | CYTOO | 30-010 | Custom-designed chip |
| CYTOOchip | CYTOO | 10-950-00-18 | Chamber |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31966-021 | high glucose, GlutaMAX Supplement |
| dNTP mix (25 mM) | Thermo Fisher Scientific | R1122 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Abcam PLC | ab150105 | |
| DTT (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich, MERCK | F4759 | |
| gentleMACS C Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Rotor-cap tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | Dissociator with heater |
| Greiner CELLSTAR Petri dish | Sigma-Aldrich, MERCK | P6987 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | |
| Horse Serum | Sigma-Aldrich, MERCK | H0146 | |
| LD column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 31150-022 | |
| NE-1000 syringe pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | Syringe pump |
| Neonatal Cardiomyocyte Isolation Cocktail, rat | Miltenyi Biotec | 130-105-420 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-098-373 | |
| Oligo-dT30VN oligonucleotides | IDT Technology | 5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′ | |
| RNAse inhibitor (40 U µL-1) | Clontech | 2313A | |
| sarcomeric α-actinin | Sigma-Aldrich, MERCK | EA-53 | |
| SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 | Confocal microscope |
| Superscript II first-strand buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| Superscript II reverse transcriptase (200 U µL-1) | Thermo Fisher Scientific | 18064071 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, MERCK | T9284 | |
| TryplE Express enzyme, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| TSO (100 µM) | QIAGEN | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′ | |
| Vibrant Dye Cycle green | Thermo Fisher Scientific | V35004 |
References
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (8), 589-600 (2006).
- Haftbaradaran Esfahani, P., et al. Cell shape determines gene expression: cardiomyocyte morphotypic transcriptomes. Basic Research in Cardiology. 115 (1), 7 (2019).
- Kontrogianni-Konstantopoulos, A., Benian, G., Granzier, H. Advances in Muscle Physiology and Pathophysiology 2011. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 930836 (2012).
- Hill, J. A., Olson, E. N. Cardiac plasticity. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).
- Bray, M. A., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Sarcomere alignment is regulated by myocyte shape. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (8), 641-651 (2008).
- Benjamin, I. J., Schneider, M. D. Learning from failure: congestive heart failure in the postgenomic age. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 495-499 (2005).
- Opie, L. H., Commerford, P. J., Gersh, B. J., Pfeffer, M. A. Controversies in ventricular remodelling. Lancet. 367 (9507), 356-367 (2006).
- Braunwald, E. Cardiomyopathies: An Overview. Circulation Research. 121 (7), 711-721 (2017).
- Knoll, R., et al. The cardiac mechanical stretch sensor machinery involves a Z disc complex that is defective in a subset of human dilated cardiomyopathy. Cell. 111 (7), 943-955 (2002).
- Frangogiannis, N. G. The Extracellular Matrix in Ischemic and Nonischemic Heart Failure. Circulation Research. 125 (1), 117-146 (2019).
- Marian, A. J., Braunwald, E. Hypertrophic Cardiomyopathy: Genetics, Pathogenesis, Clinical Manifestations, Diagnosis, and Therapy. Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).
- Mozaffarian, D., Caldwell, J. H. Right ventricular involvement in hypertrophic cardiomyopathy: a case report and literature review. Clinical Cardiology. 24 (1), 2-8 (2001).
- Olsson, M. C., Palmer, B. M., Stauffer, B. L., Leinwand, L. A., Moore, R. L. Morphological and functional alterations in ventricular myocytes from male transgenic mice with hypertrophic cardiomyopathy. Circulation Research. 94 (2), 201-207 (2004).
- Toepfer, C. N., et al. Hypertrophic cardiomyopathy mutations in MYBPC3 dysregulate myosin. Science Translational Medicine. 11 (476), (2019).
- McKenna, W. J., Maron, B. J., Thiene, G. Classification, Epidemiology, and Global Burden of Cardiomyopathies. Circulation Research. 121 (7), 722-730 (2017).
- Schultheiss, H. P., et al. Dilated cardiomyopathy. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 32 (2019).
- Knoll, R. A role for membrane shape and information processing in cardiac physiology. Pflugers Arch. 467 (1), 167-173 (2015).
- Rangamani, P., et al. Decoding information in cell shape. Cell. 154 (6), 1356-1369 (2013).
- Kuo, P. L., et al. Myocyte shape regulates lateral registry of sarcomeres and contractility. American Journal of Pathology. 181 (6), 2030-2037 (2012).
- Gerdes, A. M., Onodera, T., Wang, X., McCune, S. A. Myocyte remodeling during the progression to failure in rats with hypertension. Hypertension. 28 (4), 609-614 (1996).
- Kehat, I., et al. Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 regulate the balance between eccentric and concentric cardiac growth. Circulation Research. 108 (2), 176-183 (2011).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
- Kornyei, Z., et al. Cell sorting in a Petri dish controlled by computer vision. Scientific Reports. 3, 1088 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. The interdependence of membrane shape and cellular signal processing. Cell. 156 (6), 1132-1138 (2014).
