Измерение естественно приобретенных фагоцитоз-индуцирующих антител к паразитам Plasmodium falciparum с помощью анализа на основе цитометрии потока
Summary
Общая цель этого протокола заключается в том, чтобы дать инструкцию о том, как измерить способность антител, присутствующих в сере или плазме людей, естественно подверженных Plasmodium falciparum инфекции, чтобы опсонизировать и вызвать фагоцитоз паразитов инфицированных эритроцитов (ИП).
Abstract
Протокол описывает, как настроить и запустить поток цитометрии основе фагоцитоза анализ Plasmodium falciparum-инфицированныхэритроцитов (ИП) опоясывается естественно приобретенных антител IgG, характерных для VAR2CSA. VAR2CSA является паразитом антиген, который опосредует селективного секвестра ИП в плаценте, которые могут вызвать тяжелую форму малярии у беременных женщин, называется плацентарной малярии (ТЧ). Защита от ТЧ опосредована СПЕЦИФИЧЕСКИМИ антителами VAR2CSA, которые, как полагают, функционируют путем ингибирования плацентарный секвестр и/или путем опосредовки ИП для фагоцитоза. Анализ использует поздней стадии синхронизированных ИП, которые были выбраны в пробирке, чтобы выразить VAR2CSA, плазмы / сыворотки антитела от женщин с естественным приобретенным PM-специфический иммунитет, и фагоцитатической клеточной линии THP-1. Тем не менее, протокол может быть легко изменен, чтобы продать функциональность антител к любому антигену паразита, присутствуют на поверхности IE, будь то индуцированные естественным воздействием или вакцинацией. Анализ предлагает простую и высокую пропускную способность оценки, с хорошей воспроизводимости, важного функционального аспекта антител опосредованного иммунитета при малярии. Поэтому он полезен при оценке клинического иммунитета к малярии P. falciparum, основной причине заболеваемости и смертности в тропиках, особенно в странах Африки к югу от Сахары.
Introduction
Малярия является трансмиссивной болезнью, вызываемой у людей при инфицировании пяти различных видов рода Plasmodium. Наиболее распространенным видом является P. falciparum, который также отвечает за наиболее заболеваемости и смертности1. Клиническое представление малярии варьируется от аимптоматических или доброкачественных инфекций до сложных/тяжелых заболеваний, последние происходят в основном у детей в возрасте до пяти лет. Воздействие P. falciparum не вызывает стерильного иммунитета, но у людей, живущих в эндемичных районах, медленно развивается иммунитет против клинической болезни. Защита зависит от возраста/экспозиции, а иммунитет обычно приобретается в течение первых 5-10 лет жизни2. Взрослые женщины являются важным исключением, так как тяжелая малярия может произойти во время беременности в клинической презентации, известной как плацентарный малярии (ТЧ). ТЧ является важной причиной абортов, мертворождений, преждевременных родов, низкой массы тела при рождении, смерти плода и материнской анемии. Сопротивление PM развивается в течение последовательных беременностей3. Защита от ТЧ связана с приобретением антител против PFEMP1 типа VAR2CSA4,5,инфицированного эритроцита (IE) поверхностного антигена, который связывает хондроитин сульфат A (CSA), позволяющий IE секвестрации в плаценте. Антитела посредником защиты выполнения различных функциональных мероприятий(рассмотрены в 6,7), в том числе опсонизации ИЭ, чтобы вызвать фагоцитоз. Ранние исследования in vitro показали, что антитела могут ограничить рост P. falciparum в присутствии моноцитов через фагоцитоз8,9. Более поздние исследования показали, что более высокие уровни фагоцитоз-индуцирующих антител связаны с лучшими исходами беременности (в контексте со-инфекции ВИЧ)10,11, что свидетельствует об актуальности этой функции эффектора в естественно приобретенных иммунных реакций.
Здесь мы представляем протокол для измерения этой функции антител, присутствующих в плазме/сыворотке человека, используя in vitro культурные IEs, выражаюющие VAR2CSA вместе с моноцитной линией THP-1. Анализ был ранее использован11 , 12,13,14,1514,16,17,18 и считаетсяулучшенным и более простой подход по сравнению с предыдущими микроскопомна основе протоколов 8, так как это позволяет тестирование большего числа образцов антител в одном запуске с использованием меньших объемов антител и избежать утомительного и предвзятого подсчета микроскопии. Несмотря на то, что анализ использовался несколькими лабораториями и его выполнение достаточно просто, оно требует тщательного планирования и подготовки, поэтому подробный протокол позволит использовать его лабораториям и исследователям, не имеющим предыдущего опыта. В качестве примера мы используем синхронизированные ИИ на поздней стадии, выражаюющие VAR2CSA, оссонированные антителами, присутствующими в сыворотке крови, собранными у женщин с естественным ТЧ-специфическим иммунитетом. Тем не менее, протокол может быть легко изменен, чтобы продать функциональность антител к любому антигену паразита, присутствуют на поверхности IE, будь то индуцированные естественным воздействием или вакцинацией.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленный здесь, был ранееописан и использован 12,15,17,31 для измерения способностиантител,направленных на поверхность P. falciparum IEs, чтобы вызвать опсонизацию и фагоцитоз клетками THP-1. Представленные з…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Майкен Висти благодарит за отличную техническую помощь. Эта работа частично финансировалась за счет гранта (MAVARECA II; 17-02-KU) министерства иностранных дел Дании и администрироваться Центром стипендий Даниды. Спонсор не играл никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Materials
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
- World Health Organization. World Malaria Report – 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
- Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
- Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
- Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
- Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
- Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
- Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
- Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
- Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
- Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
- Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
- Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
- Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
- Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
- Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
- Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
- Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
- Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
- Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
- Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
- Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. . Methods in Malaria Research. , (2013).
- WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s Guide. World Health Organization. , (1991).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc’yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
- Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
- Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).
