フローサイトメトリーベースアッセイによる熱帯 熱マラリア原 虫に対する自然獲得食細胞症誘導抗体の測定
Summary
このプロトコルの全体的な目標は、自然に 熱帯熱マラリア原虫 感染にさらされた個人のセラまたは血漿中に存在する抗体の容量を測定する方法についての指示を提供し、寄生虫感染赤血球(IE)の貪食を誘導する。
Abstract
プロトコルは、VAR2CSAに特異的な自然に取得したIgG抗体によってオソニンを生成した熱帯熱マラリア 原虫(IE)のフローサイトメトリーベースの食作用アッセイを設定して実行する方法を説明しています。VAR2CSAは、胎盤マラリア(PM)と呼ばれる妊婦に重篤な形態のマラリアを引き起こす可能性のある胎盤中のIEの選択的隔離を媒介する寄生虫抗原である。PMからの保護は、胎盤隔離を阻害することによって機能すると考えられているVAR2CSA特異的抗体および/または食細胞性のためのIEを助長することによって媒介される。このアッセイは、VAR2CSA、自然に獲得したPM特異的免疫を有する女性からの血漿/血清抗体、および食作用細胞株THP-1を発現するために インビトロで 選択された後期同期IEを採用している。しかし、プロトコルは、IE表面に存在する任意の寄生虫抗原に対する抗体の機能性を、自然暴露によって誘導されるか、またはワクチン接種によって誘発されるか否かを容易にアッセイするように修飾することができる。このアッセイは、マラリアにおける抗体媒介性免疫の重要な機能的側面を再現性の高い、シンプルで高スループットの評価を提供します。したがって、熱帯地方、特にサハラ以南のアフリカにおける罹患率と死亡率の主な原因である P.熱帯熱マラリア に対する臨床免疫を評価する際に有用である。
Introduction
マラリアは、5種類のマラリア原虫属に感染したヒトに引き起こされるベクター媒介性疾患である。最も一般的な種はP.熱帯熱化であり、最も罹患率と死亡率も1に及んでいます。マラリアの臨床プレゼンテーションは、無症候性または良性感染症から複雑/重度の疾患までさまざまであり、後者は主に5歳未満の小児で発生する。P.熱帯熱化は、無菌免疫を誘発しませんが、固有の地域に住む個人は、臨床疾患に対する免疫をゆっくりと発症します。保護は年齢/暴露依存であり、免疫は通常、人生の最初の5〜10年の間に取得される2.成人女性は、胎盤マラリア(PM)として知られている臨床プレゼンテーションで妊娠中に重度のマラリアが発生する可能性がありますので、重要な例外です。PMは、中絶、死産、早産、低出生体重、胎児死亡、および母性貧血の重要な原因である。PMに対する耐性は、連続妊娠3を超えて発達する。PMからの保護は、VAR2CSA型PfEMP144,55に対する抗体の取得に関連しており、コンドロイチン硫酸A(CSA)に結合する感染性赤血球(IE)表面抗原であり、胎盤内でのIE隔離を可能にする。抗体は、様々な機能活性を行う抗体媒介性保護(6,7),7に、食作用を誘導するIEのオプゾン化を含む。初期のin vitro研究は、抗体が貪食症88、99を介して単球の存在下でP.熱帯熱岩の成長を制限できることを示した。最近の研究では、より高いレベルの貪食誘導抗体が、より良い妊娠結果(HIV共感染の文脈において)10,11に関連していることを示しており10、11自然に獲得した免疫応答におけるこのエフェクター機能の関連性を示している。
ここでは、VAR2CSAを発現するin vitro培養IEを単球線THP-1と共に用いて、ヒト血漿/血清中に存在する抗体のこの機能を測定するプロトコルを提示する。アッ8セイは以前に11、12、13、14、15、16、17、18を使用しており、より少量の抗体を使用して1回の実行でより多くの抗体サンプルをテストし、退屈で偏った顕微鏡検数を避けるため、以前の顕微鏡ベースのプロトコル8と比較して改善され、より簡単なアプローチと考えられています。11,12,13,14,15,16,17,18アッセイは複数の研究所で使用されており、その実行は十分に簡単ですが、慎重な計画と準備が必要であるため、詳細なプロトコルは、以前の経験を欠いている研究所や研究者による適用を可能にします。我々は、一例として、自然に獲得したPM特異的免疫を有する女性から採取された血清中に存在する抗体を用いてVAR2CSA opson化された後期同期IEを使用する。しかし、プロトコルは、IE表面に存在する任意の寄生虫抗原に対する抗体の機能性を、自然暴露によって誘導されるか、またはワクチン接種によって誘発されるか否かを容易にアッセイするように修飾することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提示されるプロトコルは、前述し、12、15、17、3115,17,31を使用して12、P.熱帯熱化IEの表面を標的とする抗体の容量を測定し、THP-1細胞によるオプトニゼーションおよび貪食を誘導する。ここで示した結果は、P.熱帯熱膜固有領域に住む女性の血漿/血清中の天然に獲得したVAR2CSA特…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マイケン・ビスティは、優れた技術支援に感謝しています。この作品の一部は、デンマーク外務省からの助成金(MAVARECA II;17-02-KU)によって資金提供され、ダニダ・フェローシップ・センターが管理していました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成には何の役割も持っていませんでした。
Materials
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
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