قياس المكتسبة بشكل طبيعي Phagocytosis-تحريض الأجسام المضادة لبلاموديوم فالسيباروم الطفيليات من قبل تدفق Cytometry القائم على المقايسة
Summary
الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير تعليمات حول كيفية قياس قدرة الأجسام المضادة الموجودة في سيرا أو البلازما للأفراد ، المعرضين بشكل طبيعي لعدوى بالسيباروم البلازمودي ، لopsonize والحث على البلعميات الحمراء المصابة بالطفيليات (IEs).
Abstract
يصف البروتوكول كيفية إعداد وتشغيل مقايسة البلعة المستندة إلى الخلايا المتدفقة من plasmodium falciparum-eded inedethrotes (IEs) التي تم التقاطها من قبل الأجسام المضادة IgG المكتسبة بشكل طبيعي محددة لـ VAR2CSA. VAR2CSA هو مستضد الطفيليات التي تتوسط في عزل انتقائي لل IEs في المشيمة التي يمكن أن تسبب شكلًا حادًا من الملاريا لدى النساء الحوامل ، وتسمى الملاريا المشيمة (PM). يتم توسط الحماية من PM بواسطة الأجسام المضادة VAR2CSA الخاصة التي يعتقد أنها تعمل عن طريق تثبيط عزل المشيمة و / أو عن طريق opsonizing IEs للبالعميات. يستخدم الفحص IEs في مرحلة متأخرة من متزامنة التي تم اختيارها في المختبر للتعبير عن VAR2CSA ، والهيئات المضادة للبيات البلازما / المصل من النساء ذوات مناعة PM محددة بشكل طبيعي ، وخط الخلايا الفاتجية THP-1. ومع ذلك، يمكن تعديل البروتوكول بسهولة إلى فحص وظيفة الأجسام المضادة إلى أي مستضد طفيلي موجود على سطح IE، سواء كان ذلك بسبب التعرض الطبيعي أو التطعيم. تقدم هذه المقايسة تقييم بسيط وعالي الإنتاجية، مع قابلية جيدة للتكرار، لجانب وظيفي مهم من مناعة الأجسام المضادة بوساطة في الملاريا. ولذلك، فإنه مفيد عند تقييم المناعة السريرية ضد الملاريا P. فالسيباروم، وهي سبب رئيسي للاعتلال والوفيات في المناطق المدارية، وخاصة في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى.
Introduction
الملاريا هي مرض ينتقل بالنواقل يسبب في البشر عند العدوى مع خمسة أنواع مختلفة من جنس بلازموديوم. الأنواع الأكثر انتشارا هي P. falciparum، والتي هي أيضا مسؤولة عن معظم المراضة والوفيات1. يختلف العرض السريري للملاريا من التهابات غير أعراضية أو حميدة إلى مرض معقد/شديد، ويحدث هذا الأخير في الغالب في الأطفال دون سن الخامسة. لا يؤدي التعرض لـ P. falciparum إلى مناعة معقمة ، ولكن الأفراد الذين يعيشون في المناطق المتوطنة يطورون ببطء مناعة ضد المرض السريري. الحماية هي العمر / التعرض التبعية ويتم اكتساب الحصانة عادة خلال أول 5-10 سنوات من الحياة2. تعتبر النساء البالغات استثناءً هاماً، حيث يمكن أن تحدث الملاريا الحادة أثناء الحمل في عرض سريري يعرف باسم الملاريا المشيمة (PM). PM هو سبب مهم للإجهاض، والإملاص، والولادة المبكرة، وانخفاض الوزن عند الولادة، ووفاة الجنين، وفقر الدم الأمومي. مقاومة PM يتطور على الحمل المتعاقب3. وترتبط الحماية من PM مع اكتساب الأجسام المضادة ضد VAR2CSA-نوع PfEMP14,5, مستضد سطح الدم الحمراء المصاب (IE) الذي يربط مع كبريتات شوندروتين A (CSA) تمكين عزل IE في المشيمة. الأجسام المضادة توسط حماية أداء مختلف الأنشطة الوظيفية (استعرض في6،7)بما في ذلك opsonization من الـ IEs للحث على phagocytosis. أظهرت الدراسات في المختبر في وقت مبكر أن الأجسام المضادة يمكن أن تحد من P. فالسيباروم النمو في وجود monocytes عبر البلعميات8,9. وقد أظهرت دراسات أكثر حداثة أن مستويات أعلى من الأجسام المضادة المحفزة للزناغة ترتبط مع أفضل نتائج الحمل (في سياق فيروس نقص المناعة البشرية المشترك العدوى)10,11, مما يدل على أهمية هذه الوظيفة المفعول في الاستجابة المناعية المكتسبة بشكل طبيعي.
هنا نقدم بروتوكول لقياس هذه الوظيفة من الأجسام المضادة الموجودة في البلازما البشرية / المصل، وذلك باستخدام في المختبر IEs مثقف التعبير عن VAR2CSA مع خط أحادية THP-1. وقد استخدمت سابقا في الفحص11,12,13,14,15,16,17,18 ويعتبر نهجا محسنا وأسهل مقارنة مع البروتوكولات المجهرية في وقت سابق8, لأنه يسمح باختبار عدد أكبر من عينات الأجسام المضادة في تشغيل واحد باستخدام كميات أصغر من الأجسام المضادة وتجنب العد المجهري الممل والمتحيز. على الرغم من أن الفحص قد استخدم من قبل مختبرات متعددة وتنفيذه بسيط بما فيه الكفاية ، فإنه يتطلب تخطيطًا وإعدادًا دقيقين ، لذلك ، فإن بروتوكولًا مفصلًا سيسمح بتطبيقه من قبل المختبرات والباحثين الذين يفتقرون إلى الخبرة السابقة. نحن نستخدم، كمثال، في مرحلة متأخرة من مرحلة المتزامنة IEs التعبير عن VAR2CSA opsonized مع الأجسام المضادة الموجودة في المصل التي تم جمعها من النساء مع مناعة PM المكتسبة بشكل طبيعي محددة. ومع ذلك، يمكن تعديل البروتوكول بسهولة إلى فحص وظيفة الأجسام المضادة إلى أي مستضد طفيلي موجود على سطح IE، سواء كان ذلك بسبب التعرض الطبيعي أو التطعيم.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول المقدم هنا قد سبق وصفه واستخدامه12،15،17،31 لقياس قدرة الأجسام المضادة التي تستهدف سطح P. falciparum IEs للحث على opsonization والبلعوم من قبل الخلايا THP – 1. وتركز النتائج المقدمة هنا على الأجسام المضادة التي تم الحصول ع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
مايكن فيستي هو الشكر للمساعدة التقنية الممتازة. وقد تم تمويل هذا العمل جزئياً من منحة (MAVARECA II؛ 17-02-KU) من وزارة الخارجية في الدانمرك، ويديرها مركز زمالة دانيدا. ولم يكن للممول أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو قرار نشرها، أو إعدادها.
Materials
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
References
- World Health Organization. World Malaria Report – 2018. World Health Organization. , (2018).
- Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
- Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
- Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
- Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
- Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
- Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
- Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
- Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
- Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
- Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
- Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
- Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
- Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
- Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
- Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
- Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
- Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
- Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
- Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
- Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
- Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
- Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
- Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. . Methods in Malaria Research. , (2013).
- WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner’s Guide. World Health Organization. , (1991).
- Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc’yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
- Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
- Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).
