Misurazione di anticorpi che inducono la fagonenza acquisita naturalmente ai parassiti Plasmodium falciparum mediante un'analisi basata sulla citometria del flusso
Summary
L’obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire istruzioni su come misurare la capacità degli anticorpi presenti nella sera o nel plasma degli individui, naturalmente esposti all’infezione da Plasmodium falciparum, di opsonizzare e indurre la fagonitosi degli etriciti infettati da parassiti (IE).
Abstract
Il protocollo descrive come impostare ed eseguire un’analisi della faciocitosi basata sulla citometria di flusso di erythrociti (IE) infettati da Plasmodium falciparum(IEs) opsonizzati da anticorpi IgG acquisiti naturalmente specifici per VAR2CSA. VAR2CSA è l’antigene parassita che media il sequestro selettivo di IE nella placenta che può causare una grave forma di malaria nelle donne in gravidanza, chiamata malaria placentale (PM). La protezione da PM è mediata da anticorpi specifici di VAR2CSA che si ritiene funzionino inibendo il sequestro placente e/o opsonizzando IEs per la fagocitosi. Il saggio impiega IE sincronizzati in fase avanzata che sono stati selezionati in vitro per esprimere VAR2CSA, plasma/siero-anticorpi da donne con immunità specifica PM acquisita naturalmente, e la linea cellulare fagocitica THP-1. Tuttavia, il protocollo può essere facilmente modificato per valutare la funzionalità degli anticorpi contro qualsiasi antigene parassita presente sulla superficie IE, sia indotto dall’esposizione naturale o dalla vaccinazione. Il saggio offre una valutazione semplice e ad alto rendimento, con buona riproducibilità, di un importante aspetto funzionale dell’immunità mediata dagli anticorpi nella malaria. È quindi utile quando si valuta l’immunità clinica alla malaria di P. falciparum, una delle principali cause di morbilità e mortalità nei tropici, in particolare nell’Africa sub-sahariana.
Introduction
La malaria è una malattia trasmessa da vettori causata nell’uomo dopo l’infezione con cinque diverse specie del genere Plasmodium. La specie più diffusa è P. falciparum, che è anche responsabile della maggior morbilità e mortalità1. La presentazione clinica della malaria varia da infezioni asintomatiche o benigne a malattie complicate/gravi, quest’ultima che si verifica principalmente nei bambini di età inferiore ai cinque anni. L’esposizione a P. falciparum non induce l’immunità sterile, ma gli individui che vivono in aree endemiche sviluppano lentamente l’immunità contro la malattia clinica. La protezione dipende dall’età/esposizione e l’immunità viene normalmente acquisita durante i primi 5-10 anni di vita2. Le donne adulte sono un’eccezione importante, in quanto la malaria grave può verificarsi durante la gravidanza in una presentazione clinica nota come malaria placenteale (PM). Pm è una causa importante di aborto, parto morto, parto prematuro, basso peso alla nascita, morte fetale e anemia materna. La resistenza al PM si sviluppa su gravidanze successive3. La protezione da PM è associata all’acquisizione di anticorpi contro il tipo VAR2CSA PfEMP14,5, un antigene superficiale di etritocite infetto (IE) che si lega al solfato di condroitina A (CSA) consentendo il sequestro IE nella placenta. Gli anticorpi mediano la protezione svolgendo varie attività funzionali (riviste in6,7) tra cui l’opsonizzazione di IE per indurre la fagocitosi. I primi studi in vitro hanno dimostrato che gli anticorpi possono limitare la crescita di P. falciparum in presenza di monociti tramite fagocitosi8,9. Studi più recenti hanno dimostrato che livelli più elevati di anticorpi che inducono la fagocitosi sono associati a migliori esiti di gravidanza (nel contesto della co-infezione da HIV)10,11, indicando la rilevanza di questa funzione ersione nella risposta immunitaria naturalmente acquisita.
Qui presentiamo un protocollo per misurare questa funzione di anticorpi presenti nel plasma/siero umano, utilizzando IE in vitro colture che esprimono VAR2CSA insieme alla linea monocita THP-1. Il saggio è stato precedentemente utilizzato11,12,13,1414,15,16,17,18 edè considerato un approccio migliorato e più facile rispetto ai protocolli precedenti basati sumicroscopio 8, poiché consente la sperimentazione di un maggior numero di campioni di anticorpi in una singola corsa utilizzando piccoli volumi di anticorpi ed evitando il conteggio della microscopia noiosa e di parte. Anche se il saggio è stato utilizzato da più laboratori e la sua esecuzione è abbastanza semplice, richiede un’attenta pianificazione e preparazione, quindi, un protocollo dettagliato consentirebbe la sua applicazione da laboratori e ricercatori privi di esperienza precedente. Usiamo, ad esempio, IE sincronizzati in fase avanzata che esprimono VAR2CSA opsonizzati con anticorpi presenti nel siero raccolti da donne con immunità specifica PM acquisita naturalmente. Tuttavia, il protocollo può essere facilmente modificato per valutare la funzionalità degli anticorpi contro qualsiasi antigene parassita presente sulla superficie IE, sia indotto dall’esposizione naturale o dalla vaccinazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui presentato è stato precedentemente descritto e utilizzato12,15,17,31 per misurare la capacità di anticorpi mirati alla superficie di P. falciparum IEs per indurre l’opsonizzazione e la faagocitosi da cellule THP-1. I risultati qui presentati si concentrano sugli anticorpi specifici var2CSA acquisiti naturalmente nel plasma/siero delle donne che vivono in una reg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maiken Visti è ringraziato per l’eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato in parte finanziato da una sovvenzione (MAVARECA II; 17-02-KU) del Ministero degli Affari Esteri della Danimarca e amministrata dal Danida Fellowship Centre. Il finanziatore non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
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