Bu protokolün genel amacı, plasmodium falciparum enfeksiyonuna doğal olarak maruz kalan bireylerin sera veya plazmasında bulunan antikorların kapasitesinin nasıl ölçüleceklerine, parazit enfekte eritrositlerin (IEs) fagositozunu opsonize etmek ve indüklemek tir.
Protokol, VAR2CSA’ya özgü doğal olarak edinilmiş IgG antikorları tarafından opsonize edilen Plasmodium falciparumenfekte eritrositlerin (IEs) akış sitometri tabanlı fagositoz testinin nasıl kurulup çalıştırılabildiğini açıklamaktadır. VAR2CSA, plasentadaki IE’lerin seçici sekansasyonuna aracılık eden ve plasental sıtma (PM) adı verilen hamile kadınlarda ciddi bir sıtma formuna neden olabilecek parazit antijenidir. PM’den korunma, plasental sekestrasyonu inhibe ederek ve/veya fagositoz için IE’leri opsonize ederek çalıştığına inanılan VAR2CSA spesifik antikorlar aracılık eder. Taht, VAR2CSA’yı ifade etmek için in vitro olarak seçilen geç evre senkronize IE’ler, doğal olarak edinilmiş PM spesifik bağışıklığı olan kadınlardan plazma/serum-antikorları ve fagositik hücre hattı THP-1’i kullanır. Ancak protokol, ister doğal maruzkalma ister aşılama ile indüklenen, IE yüzeyinde bulunan herhangi bir parazit antijenine antikorların işlevselliğini test etmek için kolayca değiştirilebilir. Titre, sıtmada antikor aracılı bağışıklığın önemli bir fonksiyonel yönünüiyi tekrarlanabilirlik ile basit ve yüksek iş letimatisi değerlendirme sunar. Bu nedenle, özellikle Sahra-altı Afrika’da, tropik bölgelerde morbidite ve mortalitenin önemli bir nedeni olan P. falciparum sıtmasına karşı klinik bağışıklığı değerlendirirken yararlıdır.
Sıtma, Plasmodiumcinsinin beş farklı türüyle enfeksiyon anına bağlı olarak insanlarda meydana gelen vektör kaynaklı bir hastalıktır. En yaygın türler P. falciparum, aynı zamanda en morbidite ve mortalite sorumludur1. Sıtma klinik sunumu asemptomatik veya benign enfeksiyonlardan komplike/ağır hastalıklara kadar değişmekteolup, ikincisi çoğunlukla beş yaşın altındaki çocuklarda görülür. P. falciparum maruz steril bağışıklık neden olmaz, ancak endemik bölgelerde yaşayan bireyler yavaş yavaş klinik hastalığa karşı bağışıklık geliştirmek. Koruma yaşa/maruziyete bağlıdır ve bağışıklık normalde yaşamın ilk 5-10 döneminde elde edilir2. Plasental sıtma (PM) olarak bilinen klinik bir sunumda gebelik sırasında şiddetli sıtma meydana gelebileceğinden yetişkin kadınlar önemli bir istisnadır. PM kürtaj, ölü doğum, erken doğum, düşük doğum ağırlığı, fetal ölüm ve maternal anemi önemli bir nedenidir. PM direnci art arda gebelikler üzerinde gelişir3. PM’den korunma, plasentada IE sekestrasyonu sağlayan4,5kondroitin sülfat A ‘ya (CSA) bağlanan enfekte eritrosit (IE) yüzey antijenine karşı antikor ların elde edilmesiyle ilişkilidir. Antikorlar çeşitli fonksiyonel faaliyetler gerçekleştiren koruma aracılık(6,,7)Fagositagozis indüklemek için IEs opsonizasyonu da dahil olmak üzere. Erken in vitro çalışmalar antikorların fagositozyoluylamonosit varlığında P. falciparum büyümesini sınırlayabilir gösterdi 8,9. Daha yeni çalışmalar fagositoz indükleyen antikorların daha yüksek düzeyde daha iyi gebelik sonuçları ile ilişkili olduğunu göstermiştir (HIV co-enfeksiyon bağlamında)10,11, doğal olarak elde edilen bağışıklık yanıtı bu efektör fonksiyonun alaka gösteren.
Burada insan plazmasında/serumunda bulunan antikorların bu işlevini ölçmek için, VAR2CSA’yı teksit hattı THP-1 ile birlikte in vitro kültürlü IE’ler kullanarak bir protokol saklıyız. Titredaha önce kullanılmıştır11,12,13,14,15,16,17,,18 ve daha önceki mikroskop tabanlı protokollere göre geliştirilmiş ve daha kolay bir yaklaşım olarak kabul edilir8, antikor daha küçük hacimlerde kullanarak tek bir çalışmaantikor örneklerinin daha büyük sayıda test sağlar ve sıkıcı ve önyargılı mikroskop sayma kaçınarak beri. Tayın birden fazla laboratuvar tarafından kullanılmasına ve yürütülmesi yeterince basit olmasına rağmen, dikkatli bir planlama ve hazırlık gerektirir, bu nedenle ayrıntılı bir protokol laboratuvarlar ve araştırmacılar tarafından daha önce deneyimi olmayan uygulamalara izin verir. Örnek olarak, doğal olarak elde edilen PM’ye özgü bağışıklığı olan kadınlardan toplanan serumda bulunan antikorlarla opsonize edilmiş VAR2CSA’yı ifade eden geç evre senkronize edilmiş IE’leri kullanıyoruz. Ancak protokol, ister doğal maruzkalma ister aşılama ile indüklenen, IE yüzeyinde bulunan herhangi bir parazit antijenine antikorların işlevselliğini test etmek için kolayca değiştirilebilir.
Burada sunulan protokol daha önce tanımlanmış ve thp-1 hücreleri tarafından opsonizasyon ve fagositoz indüklemek için P. falciparum IEs yüzeyini hedefleyen antikorların kapasitesini ölçmek için12,15,17,31 kullanılmıştır. Burada sunulan sonuçlar, P. falciparum endemik bölgede yaşayan kadınların plazma/serumunda doğal olarak edinilmiş VAR2CSA spesifik ant…
The authors have nothing to disclose.
Maiken Visti mükemmel teknik yardım için teşekkür edilir. Bu çalışma kısmen Danimarka Dışişleri Bakanlığı’ndan bir hibe (MAVARECA II; 17-02-KU) tarafından finanse edilmiş ve Danida Burs Merkezi tarafından yönetilmiştir. Funder çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayımlama kararı, ya da el yazması hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.
96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
DPBS | Sigma | P8622 | |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |