Medindo anticorpos indutores de fagocitose naturalmente adquiridos para parasitas plasmodium falciparum por um ensaio baseado em citometria de fluxo
Summary
O objetivo geral deste protocolo é fornecer instruções sobre como medir a capacidade dos anticorpos presentes no soro ou plasma de indivíduos, naturalmente expostos à infecção por Plasmodium falciparum, para opsonizar e induzir fagocitose dos eritrócitos infectados por parasitas (IEs).
Abstract
O protocolo descreve como configurar e executar um ensaio de fagocitose baseado em citometria de fluxo de plasmodium falciparum-infectado eritrócitos (IEs) opsonizados por anticorpos IgG naturalmente adquiridos específicos para VAR2CSA. VAR2CSA é o antígeno parasita que media o sequestro seletivo de IEs na placenta que pode causar uma forma grave de malária em gestantes, chamada malária placentária (PM). A proteção contra PM é mediada por anticorpos específicos var2CSA que se acredita funcionar inibindo o sequestro placentário e/ou opssonizando IEs para fagocitose. O ensaio emprega IEs sincronizados em estágio final que foram selecionados in vitro para expressar VAR2CSA, plasma/soro-anticorpos de mulheres com imunidade específica de PM adquirida naturalmente, e a linha de células fagocíticas THP-1. No entanto, o protocolo pode ser facilmente modificado para avaliar a funcionalidade de anticorpos para qualquer antígeno parasita presente na superfície do IE, seja induzido pela exposição natural ou pela vacinação. O ensaio oferece avaliação simples e de alto rendimento, com boa reprodutibilidade, de um importante aspecto funcional da imunidade mediada por anticorpos na malária. É, portanto, útil na avaliação da imunidade clínica à malária P. falciparum, uma das principais causas de morbidade e mortalidade nos trópicos, particularmente na África subsaariana.
Introduction
A malária é uma doença transmitida por vetores causada em humanos após infecção com cinco espécies diferentes do gênero Plasmodium. A espécie mais prevalente é a P. falciparum,que também é responsável pela maior morbidade e mortalidade1. A apresentação clínica da malária varia de infecções assintomáticas ou benignas a doenças complicadas/graves, esta última ocorrendo principalmente em crianças menores de cinco anos. A exposição ao P. falciparum não induz imunidade estéril, mas indivíduos que vivem em áreas endêmicas lentamente desenvolvem imunidade contra a doença clínica. A proteção é dependente de idade/exposição e a imunidade é adquirida normalmente durante os primeiros 5-10 anos de vida2. As mulheres adultas são uma exceção importante, pois a malária grave pode ocorrer durante a gravidez em uma apresentação clínica conhecida como malária placentária (PM). A PM é uma importante causa de aborto, natimorto, parto prematuro, baixo peso ao nascer, morte fetal e anemia materna. A resistência à PM se desenvolve ao longo de sucessivas gestações3. A proteção contra a PM está associada à aquisição de anticorpos contra o PfEMP14,5, um antígeno de superfície eritrócito infectado (IE) que se liga ao sulfato de condroitina A (CSA) que permite o sequestro de IE na placenta. Anticorpos mediam a proteção realizando diversas atividades funcionais (revisadas em6,7) incluindo a opsonização das EIs para induzir a fagocitose. Estudos in vitro in vitro mostraram que os anticorpos podem limitar o crescimento de P. falciparum na presença de monócitos via fagocitose8,9. Estudos mais recentes têm demonstrado que níveis mais elevados de anticorpos indutores de fagocitose estão associados a melhores desfechos de gravidez (no contexto da co-infecção pelo HIV)10,11, indicando a relevância dessa função efetiva na resposta imune adquirida naturalmente.
Aqui apresentamos um protocolo para medir essa função de anticorpos presentes no plasma/soro humano, utilizando IEs in vitro cultivados expressando VAR2CSA juntamente com a linha de monócitoS THP-1. O ensaio foi usado anteriormente11,12,13,14,15,16,17,18 e é considerado uma abordagem melhorada e mais fácil em comparação com os protocolos anteriores baseados em microscópio8, uma vez que permite o teste de um número maior de amostras de anticorpos em uma única corrida usando volumes menores de anticorpos e evitando a contagem de microcópia tediosa e tendenciosa. Embora o ensaio tenha sido usado por vários laboratórios e sua execução seja bastante simples, requer um planejamento e preparação cuidadosos, portanto, um protocolo detalhado permitiria sua aplicação por laboratórios e pesquisadores sem experiência prévia. Usamos, como exemplo, IEs sincronizados em estágio final expressando VAR2CSA opssonizado com anticorpos presentes em soro coletados de mulheres com imunidade específica de PM adquirida naturalmente. No entanto, o protocolo pode ser facilmente modificado para avaliar a funcionalidade de anticorpos para qualquer antígeno parasita presente na superfície do IE, seja induzido pela exposição natural ou pela vacinação.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui apresentado foi previamente descrito e utilizado12,,15,17,31 para medir a capacidade dos anticorpos voltados para a superfície das IEs de P. falciparum para induzir opsonização e fagocitose pelas células THP-1. Os resultados aqui apresentados focam em anticorpos específicos VAR2CSA adquiridos naturalmente no plasma/soro de mulheres residentes em uma região endêm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Maiken Visti é grato por excelente assistência técnica. Este trabalho foi parcialmente financiado por uma subvenção (MAVARECA II; 17-02-KU) do Ministério das Relações Exteriores da Dinamarca e administrado pelo Danida Fellowship Centre. O financiador não teve papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.
Materials
| 96 well cell culture plates, round bottom with lid | Corning | 3799 | Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use |
| AlbuMAX-II | Gibco | 11021-037 | |
| AlbuMAX-II (5%) | – | – | 5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Anti-Red Blood Cells antibody | Abcam | ab34858 | Prepare 2��l aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment. |
| DPBS | Sigma | P8622 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10003D | |
| Ethidium bromide solution | Sigma | E1510 | Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light |
| FC500 flow cytometer | Beckman Coulter | Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used. | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Heat inactivate before use. |
| FITC mouse anti-human CD16 | BD Biosciences | 555406 or 556618 | |
| FITC mouse anti-human CD32 | BD Biosciences | 552883 | |
| FITC mouse anti-human CD64 | BD Biosciences | 555527 | |
| FlowLogic software | Inivai technologies | Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist | |
| Gentamicin (10mg/mL) | Sigma | G1272 | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377 | |
| L-glutamine (200mM) | Sigma | G7513 | |
| Lysing solution | – | – | 15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA |
| MACS CS-column and accesories | Miltenyi Biotec | 130-041-305 | |
| Parasite culture medium | – | – | 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL) | Sigma | P0781 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma | R5886 | |
| THP-1 culture medium | – | – | 10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886) |
| Vario MACS magnet | Miltenyi Biotec |
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