Ein Suppressor-Bildschirm zur Charakterisierung genetischer Links, die die chronologische Lebensdauer in Saccharomyces cerevisiae regulieren

Altern ist der zeitabhängige Verlust der Integrität in unzähligen biologischen Prozessen, der letztlich die Wahrscheinlichkeit eines Organismustodes erhöht. Das Altern ist für alle Arten fast unvermeidlich. Auf zellulärer Ebene gibt es mehrere gut charakterisierte Kennzeichen, die mit dem Altern verbunden sind, einschließlich: genomische Instabilität, epigenetische Veränderungen, Verlust der Proteostase, mitochondriale Dysfunktion, deregulierte Nährstoffsensorik, zelluläre Seneszenz und Telomerat^1,2. Bei einzelligen Organismen, wie Hefen, führt dies zu einer Verringerung des reproduktiven Potentials und der chronologischen Lebensdauer^3,4. Diese zellulären Veränderungen manifestieren sich in komplexeren Organismen, wie Menschen, als Pathologien, die Krebs, Herzinsuffizienz, Neurodegeneration, Diabetes, und Osteoporose^{gehören 5,6,7}. Trotz der vielen Komplexitäten, die den Prozess des Alterns charakterisieren, gibt es die Erhaltung dieser molekularen Kennzeichen, die diesem Prozess über sehr unterschiedliche Organismen^8,9,10zugrunde liegen. Die Identifizierung von Veränderungen dieser Wege während des Alterns führte zu der Erkenntnis, dass sie durch Lebensstiländerungen manipuliert werden können – Diät-Einschränkung wird gezeigt, dass die Lebensdauer in vielen Organismen wesentlich verlängert¹¹. Diese Wege konvergieren und schneiden sich auf komplexe Weise untereinander und vielen anderen Pfaden. Die Aufklärung und Charakterisierung dieser Wechselwirkungen bietet Potenzial für therapeutische Interventionen zur Verlängerung der Lebensdauer und Der Gesundheitsspanne^12,13,14.

Die Erhaltung der molekularen Grundlagen des Alterns ermöglicht eine funktionelle Zerlegung genetischer Wechselwirkungen, die dem Prozess durch den Einsatz einfacherer Modellorganismen zugrunde liegen – einschließlich der angehenden Hefe, Saccharomyces cerevisiae^15,16. Es gibt zwei etablierte Arten von Alterung, die durch aufkeimende Hefe modelliert werden: chronologische Alterung (die chronologische Lebensdauer, CLS) und replizierende Alterung (die replizierische Lebensdauer, RLS)¹⁷. Die chronologische Alterung misst die Zeit, die eine Zelle in einem nicht dividierenden Zustand überleben kann. Dies ist analog zu der Alterung, die in Zellen gesehen wird, die den Großteil ihres Lebens in G₀verbringen, wie Neuronen⁴. Alternativ ist die replizierende Lebensdauer die Anzahl der Male, die eine Zelle vor Erschöpfung teilen kann, und ist ein Modell für mitotisch aktive Zelltypen (z. B. die Anzahl der Tochterzellen, die eine Zelle haben kann)¹⁸.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein Protokoll zu präsentieren, das die funktionelle Zerlegung der Genetik des Alterns mit S. cerevisiaeermöglicht. Während es viele ausgezeichnete Studien von vielen Forschern durchgeführt haben, die zu unserem aktuellen Verständnis geführt haben, gibt es noch viele Möglichkeiten für angehende Forscher, um zum Alterungsfeld von Anfang an in ihrer akademischen Karriere beizutragen. Wir stellen eine klare Methodik vor, die es Forschern ermöglicht, den Bereich des Alterns weiter voranzutreiben. Dieses Protokoll ist so konzipiert, dass es für alle Forscher unabhängig von der Phase ihrer akademischen Laufbahn zugänglich ist, indem es die notwendigen Werkzeuge bereitstellt, um ihre eigenen neuen Hypothesen zu formulieren und zu testen. Der Vorteil unseres Ansatzes ist, dass dies eine kostengünstige Methode ist, die für alle Forscher unabhängig von der Institution leicht zugänglich ist – und keine teure, spezialisierte Ausrüstung erfordert, die für einige Protokolle erforderlich ist¹⁹. Es gibt mehrere verschiedene Möglichkeiten, diese Art von Bildschirm zu entwerfen, der in dieser Arbeit skizzierte Ansatz ist besonders geeignet, Nullmutanten von nicht-essentiellen Genen zu untersuchen, die eine starke Verringerung der chronologischen Lebensdauer im Vergleich zu einem isogenen Wildstamm von Hefe aufweisen.

Als Beweis des Prinzips klonen wir SIR2, eine Lysin-Deacetylase, die sowohl eine verlängerte als auch eine verkürzte CLS aufweist, wenn sie überexprimiert wird. SIR2 Überexpression wurde vor kurzem festgestellt, CLS in der Weinbereitung Hefen zu erhöhen; Mehrere Gruppen haben jedoch keine Verbindung zwischen SIR2 und CLS-Erweiterung gemeldet, so dass ihre Rolle unter den Merkmalen^20,21,22bleibt. Aufgrund dieser widersprüchlichen Berichte in der Literatur haben wir dieses Gen ausgewählt, um unabhängige Forschung hinzuzufügen, um die Rolle von SIR2 in der chronologischen Alterung zu klären, falls vorhanden. Darüber hinaus verlängert das Erhöhen der Kopierzahl eines SIR2-Homologen die Lebensdauer in einem Nematoden-Wurmmodellsystem²³.

Autophagie ist ein intrazelluläres Abbausystem, um zytosolische Produkte, wie Proteine und Organellen, an das Lysom²⁴zu liefern. Autophagie ist eng mit Langlebigkeit durch seine Rolle bei der Erniedrigung beschädigter Proteine und Organellen verbunden, um zelluläre Homöostase zu erhalten²⁵. Die Induktion der Autophagie hängt von der Orchestrierung der Expression vieler Gene ab, und die Deletion des ATG1-Gens führt zu einem ungewöhnlich kurzen CLS in angehender Hefe²⁶. ATG1-Codes für eine Proteinserin/Threoninkinase, die für die Vesikelbildung in der Autophagie und den Zytoplasma-zu-Vakuole(das Pilzlysosomale Äquivalent) erforderlich ist^27,28. Hier stellen wir unsere Methode für einen erhöhten Kopiernummernbildschirm vor und testen den Effekt einer erhöhten SIR2-Kopie auf dem CLS in einem Wild-Typ und einem atg1-null-Hintergrund. Diese Methode ist besonders für junge Forscher und Forschungsgruppen an vorwiegend studentisch untersuchten Einrichtungen zugänglich, von denen viele Gemeinschaften dienen, die in den Wissenschaften unterrepräsentiert sind und über begrenzte Ressourcen verfügen.