הנה פרוטוקול לזיהוי אינטראקציות גנטיות באמצעות מסך מדכא מספר עותק מוגבר ב Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות, לשבט ולבדוק מדכאי מוטנטים שמרים קצרי מועד. אנו בודקים את ההשפעה של הגדלת מספר עותק של SIR2 על תוחלת החיים במוטציה null autophagy.
הזדקנות היא ההידרדרות התלויה בזמן של התהליכים הביולוגיים הרגילים של אורגניזם שמגבירה את ההסתברות למוות. גורמים גנטיים רבים תורמים לשינויים בתהליך ההזדקנות הרגיל. גורמים אלה מצטלבים בדרכים מורכבות, כפי שמעיד העושר של קישורים מתועדים שזוהו וורגנו באורגניזמים רבים. רוב המחקרים מתמקדים באובדן תפקוד, מוטציות Null המאפשרות הקרנה מהירה של גנים רבים בו זמנית. יש הרבה פחות עבודה שמתמקדת באיפיון התפקיד שבאופן יתר של גן בתהליך זה. בעבודה הנוכחית, אנו מציגים מתודולוגיה פשוטה כדי לזהות ולשבט גנים שמרים ניצנים, Saccharomyces cerevisiae, למחקר בדיכוי של פנוטיפ תוחלת החיים כרונולוגי קצר תוחלת חיים לראות ברקעים גנטיים רבים. פרוטוקול זה נועד להיות נגיש לחוקרים ממגוון רחב של רקעים ובצבים אקדמיים שונים. הגן SIR2, אשר קודים עבור deacetylase histone, נבחר לשיבוט בוקטור pRS315, כפי שהיו דיווחים סותרים על השפעתו על תוחלת החיים הכרונולוגית. SIR2 גם ממלא תפקיד autophagy, אשר תוצאות כאשר משובש באמצעות מחיקה של מספר גנים, כולל גורם שעתוק ATG1. כהוכחה עקרונית, אנו משכפלים את הגן SIR2 כדי לבצע מסך מדכא על פנוטיפ תוחלת החיים המקוצר האופייני למוטציה הפגויה באוטופיה ולהשוות אותו לרקע גנטי איזוגני, פראי.
הזדקנות היא אובדן תלוי הזמן של יושרה בתהליכים ביולוגיים אינספור שבסופו של דבר מגביר את ההסתברות למוות אורגני. הזדקנות היא כמעט בלתי נמנעת עבור כל המינים. ברמה התאית ישנם מספר סימני היכר מאופיינים היטב הקשורים להזדקנות, כולל: חוסר יציבות גנומית, שינויים אפיגנטיים, אובדן פרוטאוסטזיס, תפקוד מיטוכונדריאלי, חישה תזונתית מפוקחת, רגישות תאית, והתשהטלומר 1,,2. באורגניזמים חד-תאיים, כגון שמרים, הדבר מוביל לירידה בפוטנציאל המשכפל ותורוחהחיים הכרונולוגית 3,4. שינויים תאיים אלה באים לידי ביטוי אורגניזמים מורכבים יותר, כמו בני אדם, כמו פתולוגיות הכוללות סרטן, אי ספיקת לב, ניוון עצבי, סוכרת,אוסטאופורוזיס 5,,6,7. למרות המורכבות הרבות המאפיינת את תהליך ההזדקנות, יש שימור של סימני ההיכר המולקולריים האלה, המקמים את התהליך הזה על פני אורגניזמיםמפוצלים נרחבים 8,9,10. זיהוי של שינויים במסלולים אלה במהלך ההזדקנות הוביל להבנה כי הם יכולים להיות מניפולציה באמצעות שינויים באורח החיים – הגבלה תזונתית מוצגת להאריך באופן משמעותי את תוחלתהחיים באורגניזמים רבים 11. מסלולים אלה מתכנסים ומצטלבים זה עם זה ועם מסלולים רבים אחרים, בדרכים מורכבות. ההתללות והאפיון של אינטראקציות אלה מציעות פוטנציאל להתערבויות טיפוליות כדי להאריך את תוחלת החיים ואת תוחלתהחיים 12,,13,14.
שימור התבניות המולקולריות מאפשר ניתוח פונקציונלי של אינטראקציות גנטיות הבסיס לתהליך באמצעות אורגניזמים מודל פשוט יותר – כולל שמרים ניצנים, Saccharomyces cerevisiae15,16. ישנם שני סוגים מבוססים של הזדקנות במודל על ידי שמרים ניצנים: הזדקנות כרונולוגית (תוחלת החיים הכרונולוגית, CLS) והזדקנות משוכפלת (תוחלת החיים משוכפלת, RLS)17. הזדקנות כרונולוגית מודדת את משך הזמן שתא יכול לשרוד במצב שאינו מחולק. זה מקביל להזדקנות כי הוא נראה בתאים שמבלים את רוב חייהם ב G0, כגון נוירונים4. לחלופין, תוחלת חיים משוכפלת היא מספר הפעמים שתא יכול לחלק לפני תשישות והוא מודל עבור סוגי תאים פעילים mitotically (למשל, מספר תאי הבת כי תא יכול להיות)18.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להציג פרוטוקול המאפשר ניתוח פונקציונלי של הגנטיקה של הזדקנות באמצעות S. cerevisiae. אמנם היו מחקרים מצוינים רבים שבוצעו על ידי חוקרים רבים שהובילו להבנה הנוכחית שלנו, נותרו הזדמנויות רבות זמינות עבור חוקרים ניצנים לתרום לתחום ההזדקנות מתחילת הקריירה האקדמית שלהם. אנו מציגים מתודולוגיה ברורה שתאפשר לחוקרים לקדם עוד יותר את תחום ההזדקנות. פרוטוקול זה נועד להיות נגיש לכל החוקרים ללא קשר לשלב בקריירה האקדמית שלהם על ידי מתן הכלים הדרושים כדי לגבש ולבדוק את השערות הרומן שלהם. היתרון של הגישה שלנו הוא כי זוהי שיטה חסכונית נגישה לכל החוקרים ללא קשר למוסד – ואינה דורשת יקר, ציוד מיוחד הדרוש עבור פרוטוקולים מסוימים19. ישנן מספר דרכים שונות לעצב סוג זה של מסך, הגישה המתוארת בעבודה זו היא במיוחד מותנה מוטציות null של גנים לא חיוניים המציגים הפחתה חמורה תוחלת החיים הכרונולוגית לעומת זן איזוגניים מסוג בר של שמרים.
כהוכחה עקרונית שלנו, אנו לשבט SIR2, deacetylase לייסין דיווח כמוצג הן מורחבת CLS מקוצר כאשר בהגזמה. SIR2 overexpression נמצא לאחרונה להגדיל CLS שמרים ייצור יין; עם זאת, מספר קבוצות דיווחו על כל קשר בין הארכת SIR2 ל-CLS, והותירו את תפקידהתחת מאופיין 20,21,22. בשל דיווחים סותרים אלה בספרות, בחרנו בגן זה כדי להוסיף מחקר עצמאי כדי לעזור להבהיר את התפקיד של SIR2 בהזדקנות כרונולוגית, אם בכלל. בנוסף, הגדלת מספר העותק של הומולוג SIR2 מאריכה את תוחלת החיים במערכת מודל תולעת נמטודה23.
Autophagy היא מערכת השפלה תאית כדי לספק מוצרים cytosolic, כגון חלבונים organelles, כדי lysosome24. Autophagy מקושר באופן אינטימי אריכות ימים באמצעות תפקידו בהשפלה חלבונים פגומים organelles כדי לשמור על הוםאוסטזיס תאי25. אינדוקציה של autophagy תלוי תזמור הביטוי של גנים רבים, ואת המחיקה של הגן ATG1 תוצאות CLS קצר באופן חריג שמריםניצנים 26. ATG1 קודי עבור חלבון serine / קינאז threonine הנדרש עבור היווצרות שלוק autophagy ואת ציקופלסמה-כדי vacuole (המקבילה הפטרייתית lysomal)מסלול 27,28. כאן, אנו מציגים את השיטה שלנו עבור מסך מספר עותק מוגבר, בדיקת ההשפעה של עותק SIR2 מוגברת על CLS בסוג פראי ורקע atg1-null. שיטה זו מתאימה במיוחד לחוקרים זוטרים ולקבוצות מחקר במוסדות לתואר ראשון בעיקר, שרבים מהם משרתים קהילות שאינן מיוצגות כראוי במדעים ויש להן משאבים מוגבלים.
חשיפת הגנטיקה של הזדקנות היא אתגר קשה, עם הזדמנויות רבות למחקר נוסף שיכול להניב תובנות משמעותיות על האינטראקציות המורכבות הקיימות. ישנן שיטות רבות המאפשרות את הדור המהיר של מוטנטים אובדן תפקוד לחקר זנים null של שמרים45,46. שיטה זו מציגה גישה פשוטה כדי לזהות ולש…
The authors have nothing to disclose.
ג’יימס ט. ארנונה רוצה להכיר בתמיכת הסטודנטים במסלול טכנולוגיות הדנ”א הרקומביננטי ב-2017 ו-2018 באוניברסיטת ויליאם פטרסון שהיו מעורבים בפרויקט מראשיתו, אבל מאמציהם לא חצו את הסף לכתיבה: כריסטופר אנדינו, חואן בוטרו, ג’וזפין בוזאן, ברנדה קאלפה, ברנדה קובה, הדטאלאב אסל דדז’י, ארווין גאמארה, פרשסג’יפט איזיבור ויין קו, נלסון מג’יה, הקטור מוטולה, רביע נז, עבדאללה עודה, פרל פגונטלן, דניאל רזאי, גבריאלה רקטור, אאידה שנו ומתיו סו. אתם מדענים נהדרים ואני מתגעגע לכולכם!
המחברים רוצים להכיר בתמיכה רבת הערך של הוראה וטכנולוגיה מחקר באוניברסיטת ויליאם פטרסון על עזרתם: גרג מאטיסון, פיטר Cannarozzi, רוב מאייר, דנטה Portella, והנרי הייניטש. המחברים גם רוצים להכיר במשרד של הנשיא לתמיכה באמנות, משרד הדיקן והמרכז למחקר במכללה למדע ובריאות את תמיכתם בעבודה זו, ואת המחלקה לביולוגיה לתמיכה בפרויקט זה.
Fungal/Bacterial DNA kit | Zymo Research | D6005 | |
HindIIIHF enzyme | New England Biolabs | R3104S | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
Plasmid miniprep kit | Qiagen | 12123 | |
SacII enzyme | New England Biolabs | R0157S | |
Salmon sperm DNA | Thermofisher | AM9680 | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S |