شاشة القامع لتوصيف الروابط الوراثية التي تنظم العمر الزمني في Saccharomyces cerevisiae

الشيخوخة هي فقدان السلامة التي تعتمد على الوقت في عدد لا يحصى من العمليات البيولوجية التي تزيد في نهاية المطاف من احتمال موت الكائنات الحية. الشيخوخة أمر لا مفر منه تقريبا لجميع الأنواع. على المستوى الخلوي هناك العديد من السمات المميزة التي تتميز جيدا التي ترتبط بالشيخوخة، بما في ذلك: عدم الاستقرار الجينومي، والتعديلات اللاجينية، وفقدان بروتيوستاسيس، الخلل الميتوكوندريا، واستشعار المغذيات غير منظم، والشيخوخة الخلوية، والاستنزاف التيلومير^1،2. في الكائنات وحيدة الخلية، مثل الخمائر، وهذا يؤدي إلى الحد من إمكانية التكرار والعمر الزمني^3،4. تظهر هذه التغيرات الخلوية في الكائنات الحية الأكثر تعقيدًا ، مثل البشر ، كالأمراض التي تشمل السرطانات ، وفشل القلب ، والتنكس العصبي ، والسكري ، وهشاشة العظام^5،6،7. على الرغم من التعقيدات العديدة التي تميز عملية الشيخوخة ، هناك الحفاظ على هذه السمات الجزيئية الكامنة في هذه العملية عبر الكائنات الحية المتباينة على نطاق واسع^8،9،10. أدى تحديد التعديلات على هذه المسارات أثناء الشيخوخة إلى إدراك أنه يمكن التلاعب بها عن طريق تغيير نمط الحياة – يظهر التقييد الغذائي لإطالة عمر الحياة بشكل كبير في العديد من الكائنات الحية¹¹. هذه المسارات تتلاقى وتتقاطع مع بعضها البعض ومع العديد من المسارات الأخرى، بطرق معقدة. إن توضيح وتوصيف هذه التفاعلات يوفر إمكانية التدخلات العلاجية لإطالة العمر والصحة^12،13،14.

حفظ الأسس الجزيئية للشيخوخة يسمح للتشريح الوظيفي للتفاعلات الوراثية الكامنة وراء العملية من خلال استخدام أبسط الكائنات الحية نموذج – بما في ذلك في الخميرة في مهدها, Saccharomyces cerevisiae^15,16. هناك نوعان من الشيخوخة الراسخة على غرار الخميرة في مهدها: الشيخوخة الزمنية (العمر الزمني، CLS) والشيخوخة المتماثلة (عمر النسخ المتماثل، RLS)¹⁷. يقيس التقادم الزمني مقدار الوقت الذي يمكن أن تبقى الخلية في حالة غير منقسمة. وهذا مشابه للشيخوخة التي ينظر إليها في الخلايا التي تنفق غالبية حياتهم في G₀, مثل الخلايا العصبية⁴. بدلاً من ذلك، عمر تكراري هو عدد المرات التي يمكن أن تقسم خلية قبل الإرهاق وهو نموذج لأنواع الخلايا النشطة mitoticly (على سبيل المثال، عدد الخلايا البناتية التي يمكن أن يكون خلية)¹⁸.

الهدف العام من هذه الطريقة هو تقديم بروتوكول يسمح بالتشريح الوظيفي لعلم الوراثة من الشيخوخة باستخدام S. cerevisiae. في حين كانت هناك العديد من الدراسات الممتازة التي قام بها العديد من الباحثين والتي أدت إلى فهمنا الحالي ، لا تزال هناك العديد من الفرص المتاحة للباحثين الناشئين للمساهمة في مجال الشيخوخة من وقت مبكر في حياتهم الأكاديمية. نقدم منهجية واضحة من شأنها أن تسمح للباحثين للمضي قدما في مجال الشيخوخة. تم تصميم هذا البروتوكول ليكون في متناول جميع الباحثين بغض النظر عن المرحلة في حياتهم الأكاديمية من خلال توفير الأدوات اللازمة لصياغة واختبار فرضياتهم الجديدة. وميزة نهجنا هو أن هذه طريقة فعالة من حيث التكلفة يمكن الوصول إليها بسهولة لجميع الباحثين بغض النظر عن المؤسسة – ولا تتطلب معدات مكلفة ومتخصصة ضرورية لبعض البروتوكولات¹⁹. هناك عدة طرق مختلفة لتصميم هذا النوع من الشاشة ، والنهج المبين في هذا العمل هو قابل بشكل خاص لفحص المسوخ فارغة من الجينات غير الأساسية التي تظهر انخفاضا حادا في العمر الزمني مقارنة سلالة ايزوجيني البرية من الخميرة.

كدليل لدينا من حيث المبدأ، ونحن استنساخ SIR2، وهو deacetylase lysine ذكرت كما عرض كل من امتداد وCLS تقصير عندما overexeded. تم العثور مؤخرا على OVEREXPRESSION SIR2 لزيادة CLS في الخمائر صناعة النبيذ; ومع ذلك، فقد أبلغت عدة مجموعات لا توجد صلة بين SIR2 وCLS التمديد، وترك دورها تحت^20،21،22. بسبب هذه التقارير المتضاربة في الأدبيات، اخترنا هذا الجين لإضافة بحث مستقل للمساعدة في توضيح دور SIR2 في الشيخوخة الزمنية، إن وجدت. بالإضافة إلى ذلك، زيادة عدد نسخة من homologue SIR2 يمتد عمر في نظام دودة nematode نموذج^23.

Autophagy هو نظام تدهور داخل الخلايا لتقديم منتجات cytosolic ، مثل البروتينات والعضيات ، إلى lysosome²⁴. يرتبط Autophagy ارتباطا وثيقا بطول العمر من خلال دوره في البروتينات التالفة المتدهورة والعضيات للحفاظ على التوازن الخلوي²⁵. يعتمد تحريض autophagy على تنسيق التعبير عن العديد من الجينات ، وحذف جين ATG1 النتائج في CLS قصيرة بشكل غير طبيعي في خميرة²⁶في مهدها. رموز ATG1 للبروتين سيرين / ثريونين كيناز المطلوب لتكوين الحوية في autophagy وسيتوبلازم إلى vacuole (ما يعادل lyosomal الفطرية) المسار^27,28. هنا، نقدم طريقتنا لزيادة عدد الشاشة نسخة، واختبار تأثير زيادة نسخة SIR2 على CLS في نوع البرية وsهوة – خلفية فارغة atg1. وهذه الطريقة قابلة بصفة خاصة للباحثين المبتدئين ومجموعات البحث في المؤسسات الجامعية في المقام الأول، التي يخدم الكثير منها المجتمعات المحلية الممثلة تمثيلا ناقصا في العلوم وتكون مواردها محدودة.