Uno schermo soppressore per la caratterizzazione dei collegamenti genetici che regolano la durata cronologica in Saccharomyces cerevisiae

L’invecchiamento è la perdita di integrità dipendente dal tempo in una miriade di processi biologici che aumenta in ultima analisi la probabilità di morte dell’organismo. L’invecchiamento è quasi inevitabile per tutte le specie. A livello cellulare ci sono diversi segni distintivi ben caratterizzati che sono associati con l’invecchiamento, tra cui: instabilità genomica, alterazioni epigenetiche, perdita di proteostasi, disfunzione mitocondriale, rilevamento dei nutrienti deregolamentato, senescenza cellulare, e logoramento telomero^1,2. Negli organismi a singolo cellula, come i lieviti, questo porta ad una riduzione del potenziale replicativo e della durata cronologica^3,4. Questi cambiamenti cellulari si manifestano in organismi più complessi, come gli esseri umani, come patologie che includono tumori, insufficienza cardiaca, neurodegenerazione, diabete e osteoporosi^5,6,7. Nonostante le molte complessità che caratterizzano il processo di invecchiamento, c’è la conservazione di questi segni molecolari alla base di questo processo attraverso organismi ampiamente divergenti^8,9,10. L’identificazione di alterazioni a questi percorsi durante l’invecchiamento ha portato alla consapevolezza che possono essere manipolati attraverso cambiamenti di stile di vita – restrizione dietetica è indicato per estendere sostanzialmente la durata della vita in molti^{organismi 11}. Questi percorsi convergono e si intersecano tra loro e molti altri percorsi, in modi complessi. Il chiarimento e la caratterizzazione di queste interazioni offre il potenziale per interventi terapeutici per prolungare la durata della vita e la durata^{della salute 12,13,14}.

La conservazione delle basi molecolari dell’invecchiamento consente la dissezione funzionale delle interazioni genetiche alla base del processo attraverso l’uso di organismi modello più semplici – anche nel lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae^15,16. Esistono due tipi consolidati di invecchiamento modellati da lieviti in erba: l’invecchiamento cronologico (la durata cronologica della vita, CLS) e l’invecchiamento replicativo (la durata replicativa, RLS)¹⁷. L’invecchiamento cronologico misura la quantità di tempo in cui una cella può sopravvivere in uno stato non diviso. Questo è analogo all’invecchiamento che si vede nelle cellule che trascorrono la maggior parte della loro vita in G₀, come i neuroni⁴. In alternativa, la durata replicativa è il numero di volte in cui una cella può dividersi prima dell’esaurimento ed è un modello per i tipi di cellule mitoticamente attive (ad esempio, il numero di celle figlia che una cella può^{avere) 18}.

L’obiettivo generale di questo metodo è quello di presentare un protocollo che consente la dissezione funzionale della genetica dell’invecchiamento utilizzando S. cerevisiae. Mentre ci sono stati molti studi eccellenti eseguiti da molti ricercatori che hanno portato alla nostra attuale comprensione, ci sono molte opportunità disponibili per i ricercatori in erba per contribuire al campo di invecchiamento fin dall’inizio della loro carriera accademica. Vi presentiamo una metodologia chiara che permetterà ai ricercatori di far progredire ulteriormente il campo dell’invecchiamento. Questo protocollo è progettato per essere accessibile a tutti i ricercatori indipendentemente dalla fase della loro carriera accademica, fornendo gli strumenti necessari per formulare e testare le proprie nuove ipotesi. Il vantaggio del nostro approccio è che questo è un metodo conveniente facilmente accessibile a tutti i ricercatori indipendentemente dall’istituzione – e non richiede costose attrezzature specializzate necessarie per alcuni protocolli¹⁹. Ci sono diversi modi per progettare questo tipo di schermo, l’approccio delineato in questo lavoro è particolarmente sussbile per lo screening di mutanti nulli di geni non essenziali che presentano una grave riduzione della durata della vita cronologica rispetto a un ceppo isogenico di lievito di tipo selvatico.

Come prova di principio, cloniamo SIR2, una deacetilase lisina riportata come esibire sia una CLS estesa che una CLS abbreviata quando sovraespressa. Sir2 sovraespressione è stato recentemente trovato per aumentare CLS nei lieviti di vinificazione; tuttavia, diversi gruppi non hanno segnalato alcun collegamento tra SIR2 e l’estensione CLS, lasciando il suo ruolo^{sotto la caratterizzata 20,21,22}. A causa di queste relazioni contrastanti nella letteratura, abbiamo selezionato questo gene per aggiungere una ricerca indipendente per aiutare a chiarire il ruolo di SIR2 nell’invecchiamento cronologico, se presente. Inoltre, l’aumento del numero di copie di un homologue SIR2 estende la durata in un sistema di modello di worm nematode²³.

L’autofagia è un sistema di degradazione intracellulare per fornire prodotti citosolici, come proteine e organelli, al lisosoma²⁴. L’autofagia è intimamente legata alla longevità attraverso il suo ruolo nel degradare le proteine e gli organelli danneggiati per mantenere l’omeostasi cellulare²⁵. L’induzione dell’autofagia dipende dall’orchestrazione dell’espressione di molti geni, e la cancellazione del gene ATG1 si traduce in una CLS anormalmente breve nel lievito in^{erba 26}. Codici ATG1 per una proteina serina/treonina chinasi che è necessaria per la formazione di vescicole in autofagia e il cytoplasma-a-vacuole (l’equivalente lisosomiale fungino)^{percorso 27,28}. Qui, presentiamo il nostro metodo per una schermata di numero di copia aumentata, testando l’effetto di una maggiore copia DI SIR2 su CLS in un tipo selvaggio e uno sfondo atg1-null. Questo metodo è particolarmente sussbile per i giovani ricercatori e gruppi di ricerca presso le istituzioni principalmente universitarie, molte delle quali servono comunità sottorappresentate nelle scienze e hanno risorse limitate.