Супрессорный экран для характеристики генетических связей, регулирующих хронологическую продолжительность жизни в Saccharomyces cerevisiae

Старение зависит от времени потери целостности в бесчисленных биологических процессов, что в конечном итоге увеличивает вероятность смерти организма. Старение почти неизбежно для всех видов. На клеточном уровне есть несколько хорошо охарактеризованных признаков, которые связаны со старением, в том числе: геномная нестабильность, эпигенетические изменения, потеря протеостаза, митохондриальная дисфункция, дерегулированное зондирование питательных веществ, клеточное сенесценция и истощение^{теломер 1,2}. В одноклеточных организмах, таких как дрожжи, это приводит к снижению репликативного потенциала и хронологического^{периода жизни 3,,4.} Эти клеточные изменения проявляются в более сложных организмов, как люди, как патологии, которые включают рак, сердечная недостаточность, нейродегенерация, диабет и^{остеопороз 5,6,7}. Несмотря на множество сложностей, которые характеризуют процесс старения, есть сохранение этих молекулярных признаков, лежащих в основе этого процесса через^{широко расходящихся организмов 8,9,10}. Выявление изменений в этих путей во время старения привело к осознанию того, что ими можно манипулировать с помощью изменений образа жизни – как показано, ограничение питания существенно продлевает продолжительность жизни во^{многих организмах 11}. Эти пути сходятся и пересекаются друг с другом и многими другими путями, сложными способами. Выяснение и характеристика этих взаимодействий предлагает потенциал для терапевтических мероприятий для продления жизни и здоровья^12,13,14.

Сохранение молекулярной основы старения позволяет функциональное вскрытие генетических взаимодействий, лежащих в основе процесса с помощью более простых организмов модели – в том числе в начинающих дрожжей, Saccharomyces cerevisiae^15,16. Существует два установленных типа старения, смоделированных начинающими дрожжами: хронологическое старение (хронологический срок службы, CLS) и репликационные старения (репликационная продолжительность жизни, RLS)¹⁷. Хронологическое старение измеряет количество времени, в течение которого клетка может выжить в неразмежавом состоянии. Это аналогично старению, которое наблюдается в клетках, которые проводят большую часть своей жизни в G_0,таких как нейроны^4. Кроме того, срок службы репликации — это количество раз, которое клетка может разделить до истощения, и является моделью для митотически активных типов клеток (например, количество дочери клеток, которые клетка может иметь)¹⁸.

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы представить протокол, который позволяет функциональное вскрытие генетики старения с помощью S. cerevisiae. Хотя было много отличных исследований, проведенных многими исследователями, которые привели к нашему нынешнему пониманию, остается много возможностей для начинающих исследователей внести свой вклад в области старения с самого начала их академической карьеры. Мы представляем четкую методологию, которая позволит исследователям дальнейшего продвижения области старения. Этот протокол предназначен для всех исследователей, независимо от стадии их академической карьеры, предоставляя инструменты, необходимые для формулирования и тестирования своих собственных новых гипотез. Преимущество нашего подхода заключается в том, что это экономически эффективный метод, легко доступный для всех исследователей, независимо от института – и не требует дорогостоящего, специализированного оборудования, необходимого для некоторых^{протоколов 19.} Есть несколько различных способов разработки этого типа экрана, подход, изложенный в этой работе, особенно подошел к скринингу нулевых мутантов несущественные гены, которые демонстрируют серьезное сокращение хронологического срока службы по сравнению с изогенным диким типом штамма дрожжей.

В качестве нашего доказательства принципа, мы клонировать SIR2, лизин deacetylase сообщили, как экспонирование как расширенный и укороченный CLS при переэкспрессировании. SIR2 переэкспрессии было недавно установлено, увеличить CLS в виноделии дрожжей; однако, несколько групп сообщили никакой связи между РАСШИРЕНИЕм SIR2 и CLS, оставляя свою^{роль под охарактеризованными 20,,21,22}. Из-за этих противоречивых докладов в литературе, мы выбрали этот ген, чтобы добавить независимые исследования, чтобы помочь прояснить роль SIR2 в хронологическом старении, если таковые имеются. Кроме того, увеличение числа копий homologue SIR2 продлевает срок службы в системе модели нематодного червя^23.

Аутофагия является внутриклеточной системой деградации для доставки цитозолических продуктов, таких как белки и органеллы, к лизосоме²⁴. Аутофагия тесно связана с долголетием через его роль в деградации поврежденных белков и органелл для поддержания клеточного гомеостаза²⁵. Индукция аутофагии зависит от организации экспрессии многих генов, а удаление гена ATG1 приводит к аномально короткой CLS в начинающих дрожжах²⁶. ATG1 коды для белка серин / трионин киназы, которая необходима для формирования пузырьков в аутофагии и цитоплазмы до вакуола (грибковый лизосомальный эквивалент)^{путь 27,28}. Здесь мы представляем наш метод для увеличения экрана номера копии, проверяя влияние увеличенной копии SIR2 на CLS в диком типе и atg1-null фоне. Этот метод особенно податлив для младших исследователей и исследовательских групп в основном в высших учебных заведениях, многие из которых обслуживают общины, недопредставленные в науке и имеющие ограниченные ресурсы.