Summary

Imaging super-risoluzione per studiare la co-localizzazione di proteine e marcatori sinaptici nei neuroni primari

Published: October 31, 2020
doi:

Summary

Questo protocollo mostra come impiegare la microscopia super-risoluzione per studiare la co-localizzazione delle proteine nelle colture neuronali primarie.

Abstract

Le sinapsi sono gli elementi funzionali dei neuroni e i loro difetti o perdite sono alla base di diversi disturbi neurodegenerativi e neurologici. Gli studi di imaging sono ampiamente utilizzati per studiare la loro funzione e plasticità in condizioni fisiologiche e patologiche. A causa delle loro dimensioni e struttura, gli studi di localizzazione delle proteine richiedono tecniche di imaging ad alta risoluzione. In questo protocollo, descriviamo una procedura per studiare nei neuroni primari la co-localizzazione delle proteine bersaglio con marcatori sinaptici a un livello di super-risoluzione utilizzando la microscopia ad illuminazione strutturata (SIM). La SIM è una tecnica di illuminazione a luce modellata che raddoppia la risoluzione spaziale della microscopia a campo largo, raggiungendo un dettaglio di circa 100 nm. Il protocollo indica i controlli e le impostazioni necessari per robusti studi di co-localizzazione e una panoramica dei metodi statistici per analizzare correttamente i dati di imaging.

Introduction

La comprensione e la visione della sinapsi è cambiata enormemente dalla sua prima descrizione da Foster e Sherrington nel 18971. Da allora, la nostra conoscenza della comunicazione neuronale e dei processi molecolari alla base è cresciuta esponenzialmente2. È diventato chiaro che le sinapsi possono essere pensate come un sistema a due compartimenti: un compartimento pre-sinaptico contenente vesciche per il rilascio di neurotrasmettitori e un compartimento post-sinaptico con recettori3. Questa visione semplicistica, negli ultimi vent’anni, si è evoluta in una complessa rete di proteine necessarie per trasdurre il legame trasmettitore nella segnalazione4.

I vantaggi nella comprensione sono in parte dovuti a tecniche di super-risoluzione che hanno superato il limite di diffrazione della microscopia leggera convenzionale per soddisfare la dimensione delle sinapsimeglio 5,6,7,8,9,10. A causa del limite di diffrazione, un microscopio ottico non può raggiungere una risoluzione superiore a 200 nmlateralmente11,12. Per aggirare questo limite, sono state create tecniche di super-risoluzione, utilizzando approcci diversi e raggiungendo diverse risoluzioni limite di sub-diffrazione: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) e STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM raddoppia la risoluzione spaziale dei sistemi di microscopia a campo largo basati su laser inserendo una griglia di diffrazione nel percorso del fascio di eccitazione15. La grata mobile diffracts i raggi laser per creare un modello di illuminazione noto, di solito strisce. Questo modello di luce appositamente strutturato è sovrapposto alla distribuzione spaziale sconosciuta del colorante fluorescente (del campione). Le frange di interferenza formate dai due modelli codificano per dettagli fini altrimenti indistinguibili con la normale microscopia a campo largo. L’immagine finale super-risolta si ottiene combinando e decodificando con metodi matematici diverse immagini grezze dello stesso campione ottenute dalle traduzioni e rotazioni della grata di diffrazione. La risoluzione delle immagini super-risolte raggiunge i 100 nm nei 500 nm nelle direzioni assiali per 2D-SIM15 o 100 nm nei lateral e 250 nm nelle direzioni assiali per 3D-SIM16.

La nuova comprensione della sinapsi è ancora più importante alla luce dei molti disturbi neurologici in cui la disfunzione sinaptica svolge un ruolo importante nell’insorgenza e nella progressione17,18. Morbo di Alzheimer, Sindrome di Down, Morbo di Parkinson, malattie prioni, epilessia, disturbi dello spettro autistico e sindrome X fragile tra gli altri sono stati collegati ad anomalie nella composizione sinaptica, morfologia e funzione19,20,21,22.

Recentemente, utilizzando una serie di anticorpi specifici suMO, abbiamo usato la SIM per mostrare la co-localizzazione nei neuroni ippocampali primari delle proteine SUMO con i marcatori pre e post-sinaptici synaptophysin e PSD95 al livello disuper-risoluzione 23. Questo ci ha permesso di confermare la prova di microscopia biochimica e confocale della localizzazione SUMO nei neuroni.

Qui, descriviamo un protocollo per studiare la localizzazione delle proteine nei neuroni primari dell’ippocampo dei topi. Allo stesso tempo, questo protocollo può essere adattato a diversi tipi di colture neuronali primarie.

Protocol

1. Culture primarie Coltura mouse ippocampo primario neuroni in coperture camerate (come Ibidi μ-Slide 8 Well o Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) che corrispondono al requisito obiettivo per #1.5 (0.17 mm) coprelo spessore. Coperture con rivestimento camerato con 100 lL di poli-L-lysine (100 g/mL). Il giorno successivo, lavare due volte i coperture con camera con salina sterile tamponata al fosfato (PBS). Per ottenere i neuroni primari del topo, isolare gli ippocampi da P1-P4<sup…

Representative Results

Vi presentiamo qui il flusso di lavoro standard per studiare la co-localizzazione delle proteine neuronali. Abbiamo prima calibrato il microscopio e successivamente abbiamo eseguito l’analisi SIM dei campioni. Per calibrare il sistema, abbiamo usato microsfere fluorescenti di diametro di 0,1 m. Dopo aver ottenuto immagini 3D-SIM super-risolte delle perline, i dati dell’immagine sottostanti vengono trasformati da Fourier per convertirli nuovamente in una rappresentazione di frequenza spaziale. Nella F…

Discussion

Chiarire la struttura e la composizione della sinapsi è fondamentale per comprendere i processi fisiologici e patologici che regolano la memoria e la cognizione. Mentre nello stato normale, le sinapsi sono gli elementi costitutivi della memoria, sono anche alla base di disturbi neurologici complessi come il morbo di Alzheimer32. Il protocollo qui descritto serve a studiare la co-localizzazione delle proteine neuronali con una tecnica di microscopia super-risoluzione chiamata SIM. Utilizzando un p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Edoardo Micotti per la critica costruttiva del manoscritto. Lo studio è stato sostenuto da BrightFocus A2019296F, di Fondo di Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), di Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) e della Rete di Formazione Innovativa Marie skadorwska-Curie (JK).

Materials

0.4% Trypan blue solution  Thermo Fisher Scientific 15250061 Chemical
70 µm filter  Corning 352350 Equiment
Alexa Thermo Fisher Scientific Antibody
Antibody SENP1 Santa Cruz sc-271360 Antibody
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Chemical
Bovine serum albumin  Merck 5470 Chemical
CaCl2 Merck Life Science 21115 Chemical
Chambered coverslips Ibidi 80826 Equiment
DyLight Thermo Fisher Scientific Antibody
FBS (Hyclone) GIBCO SH3007002 (CHA1111L) Serum
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent Thermo Fisher Scientific F8803 Equiment
Glucose Merck Life Science G8769 Chemical
Glutamax GIBCO 35050061 Chemical
HEPES Merck Life Science H3537 Chemical
L-Cystein  Merck Life Science  C6852-25g Chemical
MAP2 Merck AB15452 Antibody
MEM  Life Technologies 21575022 Medium
MgCl Merck Life Science M8266 Chemical
NaOH VWR International 1,091,371,000 Chemical
Neurobasal A Life Technologies 10888022 Medium
N-SIM Super Resolution Microscope Nikon Instrument
Papain Merck Life Science  P-3125 Chemical
paraformaldehyde  Thermo Fisher Scientific 28908 Chemical
Pen/Strep 10x Life Technologies 15140122 Chemical
phosphate-buffered saline  Gibco 10010023 Chemical
Poly-L lysine Sigma P2636 Chemical
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970 Chemical
PSD95  NeuroMab K28/43 Antibody
Round coverglass Thermo 12052712 Equiment
SUMO1 Abcam ab32058 Antibody
Synaptophysin  Merck S5768  Antibody
Triton X-100  Merck T8787 Chemical
Trypsin inhibitor  Merck Life Science  T9003-500MG Chemical

References

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Russo, L., Natale, C., Conz, A., Kelk, J., Restelli, E., Chiesa, R., Salmona, M., Fioriti, L., Colnaghi, L. Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (164), e61434, doi:10.3791/61434 (2020).

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