Супер-разрешение изображения для изучения совместной локализации белков и синаптических маркеров в первичных нейронов
Summary
Этот протокол показывает, как использовать микроскопию супер-разрешения для изучения совместной локализации белка в первичных нейронных культурах.
Abstract
Синапсы являются функциональными элементами нейронов и их дефекты или потери находятся в основе нескольких нейродегенеративных и неврологических расстройств. Исследования изображений широко используются для исследования их функции и пластичности в физиологических и патологических условиях. Из-за их размера и структуры, локализация исследований белков требуют высокого разрешения методов визуализации. В этом протоколе мы описываем процедуру изучения в первичных нейронах совместной локализации целевых белков с синаптических маркерами на уровне супер-разрешения с использованием структурированной микроскопии освещения (SIM). SIM-карта – это метод освещения с узорным светом, который удваивает пространственное разрешение широкой микроскопии, достигая детализации около 100 нм. Протокол указывает необходимые элементы управления и настройки для надежных исследований совместной локализации и обзор статистических методов для правильного анализа данных изображений.
Introduction
Понимание и взгляд на синапсе сильно изменилось с момента его первого описания Фостер и Шеррингтон в 1897году 1. С тех пор наши знания нейрональной коммуникации и молекулярных процессов, стоящих за ней, выросли в геометрическойпрогрессии на 2. Стало ясно, что синапсы можно рассматривать как двухкомпанейную систему: до синаптический отсек, содержащий пузырьки для высвобождения нейротрансмиттеров и пост-синаптический отсек с рецепторами3. Этот упрощенный взгляд, в последние двадцать лет, превратилась в сложную сеть белков, необходимых для трансдуцирования передатчик связывания в сигнализации4.
Достижения в понимании частично из-за супер-разрешениеметодов,которые преодолели дифракционный предел обычной световой микроскопии в соответствии сизмерением синапсов лучше 5,6,,7,8,9,10. Из-за предела дифракции, оптический микроскоп не может достичь разрешения выше 200нм с другой стороны 11,12. Чтобы обойти этот предел, были созданы методы супер-разрешения, используя различные подходы и достигая различных разрешений предела субдифракции: SIM, STED (Стимулированная микроскопия истощения выбросов), PALM (ФотоАктивированная микроскопия локализации) и STORM (Стохастическая оптическая реконструкция микроскопии)13,14. SIM удваивает пространственное разрешение лазерной широкой полевой микроскопии систем, вставив дифракционную решетку в траекторию возбужденияпучка 15. Подвижная решетка дифрактов лазерных лучей для создания известного шаблона освещения, как правило, полосы. Этот намеренно структурированный световой узор накладывается на неизвестное пространственное распределение флуоресцентного красителя (образца). Интерференционные бахромы, образованные двумя шаблонами, кодируются для неразличимых мелких деталей с обычной широкой микроскопией. Окончательное сверхразрешеное изображение получено путем объединения и расшифровки математическими методами нескольких необработанных изображений одного и того же образца, полученных переводами и вращениями дифракционной решетки. Разрешение сверхпроверенные изображения достигает 100 нм в боковом и 500 нм в осяных направлениях для 2D-SIM15 или 100 нм в боковом и 250 нм в осяных направлениях для 3D-SIM16.
Новое понимание синапса является еще более важным в свете многих неврологических расстройств, где синаптическая дисфункция играет важную роль в наступлении ипрогрессии 17,18. Болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, болезнь Паркинсона, прионные заболевания, эпилепсия, расстройства аутистического спектра и хрупкий синдром Х среди других были связаны с аномалиями в синаптической композиции,морфологии и функции 19,20,21,22.
Недавно, используя набор SUMO-специфических антител, мы использовали SIM, чтобы показать ко-локализацию в первичных гиппокампа нейронов белков SUMO с до- и пост-синаптических маркеров синаптофизин и PSD95 на уровнесупер-разрешения 23. Это позволило нам подтвердить биохимические и конфокальные микроскопии доказательства локализации СУМО в нейронах.
Здесь мы описываем протокол для изучения локализации белков в гиппокампе мыши первичных нейронов. В то же время, этот протокол может быть адаптирован к различным типам первичных нейронных культур.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выяснение структуры и состава синапса имеет решающее значение для понимания физиологических и патологических процессов, которые регулируют память и познание. В то время как в нормальном состоянии, синапсы являются строительными блоками памяти, они также лежат в основе сложных неврол?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Эдоардо Микотти за конструктивную критику рукописи. Это исследование было поддержано BrightFocus A2019296F, Фондом ди Бенефикенза – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) и Мари Склодовской-Кюри Innovative Training Network (JK).
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | – | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. . A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).
- Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
- Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
- Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
- Monro, T. Beyond the diffraction limit. Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).
- Won, R. Eyes on super-resolution. Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Brose, N., O’Connor, V., Skehel, P. Synaptopathy: dysfunction of synaptic function. Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).
- Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington’s disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
- Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
- Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
- Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
- Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
- Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy – A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
- Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
- Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
