Imagerie super-résolution pour étudier la co-localisation des protéines et des marqueurs synaptiques dans les neurones primaires

La compréhension et la vue de la synapse a énormément changé depuis sa première description par Foster et Sherrington en 1897¹. Depuis lors, notre connaissance de la communication neuronale et les processus moléculaires derrière elle a augmenté de façon exponentielle². Il est devenu clair que les synapses peuvent être considérées comme un système à deux compartiments : un compartiment pré-synaptique contenant des vésicules pour la libération de neurotransmetteurs et un compartiment post-synaptique avec des récepteurs³. Cette vision simpliste, au cours des vingt dernières années, s’est transformée en un réseau complexe de protéines nécessaires pour transduire la liaison des émetteurs en signalisation⁴.

Les gains dans la compréhension sont en partie dus aux techniques de super-résolution qui ont surmonté la limite de diffraction de la microscopie légère conventionnelle pour convenir à la dimension des synapses mieux^5,6,7,8,9,10. En raison de la limite de diffraction, un microscope optique ne peut pas atteindre une résolution supérieure à 200 nm par la suite^11,12. Pour contourner cette limite, des techniques de superrésolution ont été créées, en utilisant différentes approches et en atteignant différentes résolutions limites de sous-diffraction : SIM, STED (Stimated Emission Ecution Exceed Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) et STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)^13,14. SIM double la résolution spatiale des systèmes de microscopie à large champ à base de laser en insérant une grille de diffraction dans le chemin de faisceau^{d’excitation 15}. La grille mobile diffracts les faisceaux laser pour créer un modèle d’éclairage connu, généralement rayures. Ce motif de lumière volontairement structuré est superposé à la distribution spatiale inconnue du colorant fluorescent (de l’échantillon). Les franges d’interférence formées par les deux modèles codent pour des détails fins autrement indiscernables avec la microscopie normale de large champ. L’image finale super-résolue est obtenue en combinant et décodage avec des méthodes mathématiques plusieurs images brutes du même échantillon obtenus par les traductions et les rotations de la grille de diffraction. La résolution des images super-résolues atteint 100 nm dans le côté et 500 nm dans les directions axiales pour 2D-SIM¹⁵ ou 100 nm dans le latéral et 250 nm dans les directions axiales pour 3D-SIM¹⁶.

La nouvelle compréhension de la synapse est encore plus importante à la lumière des nombreux troubles neurologiques où le dysfonctionnement synaptique joue un rôle majeur dans l’apparition et la progression^17,18. La maladie d’Alzheimer, le syndrome de Down, la maladie de Parkinson, les maladies à prions, l’épilepsie, les troubles du spectre autistique et le syndrome fragile de X, entre autres, ont été liés à des anomalies dans la composition synaptique, la morphologie et la fonction^19,20,21,22.

Récemment, à l’aide d’un ensemble d’anticorps spécifiques à sumo, nous avons utilisé sim pour montrer la co-localisation dans les neurones hippocampaux primaires des protéines SUMO avec les marqueurs pré- et post-synaptiques synaptophysine et PSD95 au niveau de super-résolution²³. Cela nous a permis de confirmer les preuves biochimiques et confocales de microscopie de la localisation sumo dans les neurones.

Ici, nous décrivons un protocole pour étudier la localisation des protéines dans les neurones primaires hippocampaux de souris. En même temps, ce protocole peut être adapté à différents types de cultures neuronales primaires.