Imágenes de Superresoridad para estudiar la co-localización de proteínas y marcadores sinápticos en neuronas primarias

La comprensión y la visión de la sinapsis ha cambiado enormemente desde su primera descripción por Foster y Sherrington en 1897¹. Desde entonces, nuestro conocimiento de la comunicación neuronal y los procesos moleculares detrás de ella ha crecido exponencialmente². Ha quedado claro que las sinapsis pueden considerarse como un sistema de dos compartimentos: un compartimento presináptico que contiene vesículas para la liberación de neurotransmisores y un compartimento postsináptico con receptores^3. Esta visión simplista, en los últimos veinte años, se ha convertido en una compleja red de proteínas necesarias para transducir la unión del transmisor a la señalización^4.

Las ganancias en el entendimiento se deben en parte a las técnicas de superrescencia que superaron el límite de difracción de la microscopía de luz convencional para adaptarse a la dimensión de las sinapsis mejores^5,6,7,8,9,10. Debido al límite de difracción, un microscopio óptico no puede alcanzar una resolución superior a 200 nm lateralmente^11,12. Para eludir este límite, se crearon técnicas de superrescencia, utilizando diferentes enfoques y alcanzando diferentes resoluciones de límite de subdifacción: SIM, STED (Microscopía de Agotamiento de Emisiones Estimuladas), PALM (Microscopía de Localización Fotoactiva) y STORM (Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica)^13,,14. SIM duplica la resolución espacial de los sistemas de microscopía de campo ancho basados en láser mediante la inserción de una rejilla de difracción en la trayectoria del haz de excitación¹⁵. La rejilla móvil difracta los rayos láser para crear un patrón de iluminación conocido, generalmente rayas. Este patrón de luz estructurado específicamente se superpone a la distribución espacial desconocida del tinte fluorescente (de la muestra). Los flecos de interferencia formados por los dos patrones codifican para detalles finos indistinguibles con microscopía de campo ancho normal. La imagen superconsfectada final se obtiene combinando y decodificando con métodos matemáticos varias imágenes crudas de la misma muestra obtenidas por las traducciones y rotaciones de la rejilla de difracción. La resolución de las imágenes superconsueltas alcanza los 100 nm en las direcciones lateral y 500 nm en las direcciones axiales para 2D-SIM¹⁵ o 100 nm en las direcciones lateral y 250 nm en las direcciones axiales para 3D-SIM¹⁶.

La nueva comprensión de la sinapsis es aún más importante a la luz de los muchos trastornos neurológicos donde la disfunción sináptica juega un papel importante en la aparición y progresión^17,,18. Enfermedad de Alzheimer, Síndrome de Down, Enfermedad de Parkinson, enfermedades priónicas, epilepsia, trastornos del espectro autista y síndrome X frágil entre otros se han relacionado con anomalías en la composición sináptica, morfología y función^{19,,20,,21,,22.}

Recientemente, utilizando un conjunto de anticuerpos específicos de SUMO, utilizamos SIM para mostrar la co-localización en las neuronas primarias del hipocampo de las proteínas SUMO con los marcadores pre y postsinápticos sinaptofisina y PSD95 en el nivel de superrescresía²³. Esto nos permitió confirmar la evidencia de microscopía bioquímica y confocal de la localización SUMO en las neuronas.

Aquí, describimos un protocolo para estudiar la localización de proteínas en las neuronas primarias del hipocampo de ratón. Al mismo tiempo, este protocolo puede adaptarse a diferentes tipos de cultivos neuronales primarios.