פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש במיקרוסקופ סופר-רזולוציה כדי ללמוד חלבון שיתוף מקומי בתרבויות עצביות עיקריות.
סינמפסות הן האלמנטים הפונקציונליים של נוירונים והפגמים או ההפסדים שלהם הם על בסיס מספר הפרעות ניווניות ונוירולוגיות. מחקרי הדמיה נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את תפקודם ואת הפלסטיות שלהם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. בשל גודלם ומבנהם, מחקרי ים-ים של חלבונים דורשים טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליך ללמוד נוירונים ראשוניים התאמה יתיקות של חלבוני היעד עם סמנים סינפטיים ברמת סופר רזולוציה באמצעות מיקרוסקופית תאורה מובנית (SIM). SIM היא טכניקת תאורה בדוגמת אור המכפילה את הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופ שדה רחב, ומגיעה לפרטים של כ-100 00 00 00 00 00 00 00:00. הפרוטוקול מציין את הפקדים וההגדרות הנדרשים עבור מחקרי התאמה יתקליזציה איתנים ודה-טה-תס על השיטות הסטטיסטיות לניתוח נתוני ההדמיה כראוי.
ההבנה והתצוגה של הסינסה השתנו מאוד מאז התיאור הראשון של פוסטר ושרינגטון ב-18971. מאז, הידע שלנו בתקשורת עצבית והתהליכים המולקולריים שמאחוריה גדל באופן אקספוננציאלי2. זה הפך להיות ברור כי סינפסות ניתן לחשוב כמערכת דו-תאים: תא טרום סינפטי המכיל שלוקות לשחרור של נוירוטרנסמיטורים ותאי פוסט-סינפטי עם קולטנים3. השקפה פשטנית זו, בעשרים השנים האחרונות, התפתחה לרשת מורכבת של החלבונים הנדרשים כדי להעביר את המשדר המחייב לאותת4.
הרווחים בהבנה נובעים בחלקם מטכניקות סופר-רזולוציה שהתגברו על מגבלת הפליטה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי כדי להתאים לממד של סינאפסותטוב יותר 5,6,7,8,,9,,10. בשל מגבלת הפליטה, מיקרוסקופ אופטי אינו יכול להגיע לרזולוציה מעל 200 00 0000 00:00:00,000———————————————————,12 כדי לעקוף מגבלה זו, טכניקות סופר רזולוציה נוצרו, באמצעות גישות שונות ולהגיע לרזולוציות שונות של מגבלת תת-עקיפה: SIM, STED (מיקרוסקופית דלדול פליטה מגורה), PALM (מיקרוסקופית התאמה מקומית PhotoActivated) ו- STORM(מיקרוסקופשחזור אופטי סטוכסטי) 13,14. SIM מכפיל את הרזולוציה המרחבית של מערכות מיקרוסקופיות רחבות שדה מבוססות לייזר על-ידי הכנסת חיתוך צורב לנתיב קרן העירור15. הסורג הניתן להזזה מדרג את קרני הלייזר כדי ליצור תבנית תאורה ידועה, בדרך כלל פסים. תבנית אור מובנית בכוונה זו על-תפוצה מרחבית לא ידועה של צבע הפלורסנט (של הדגימה). שולי ההפרעה שנוצרו על ידי שני דפוסים מקודדים לפרטים עדינים שלא ניתן להבחין בהם עם מיקרוסקופיה רגילה בשטח רחב. התמונה הסופית סופר נפתרה מתקבלת על ידי שילוב ופענוח עם שיטות מתמטיות מספר תמונות גלם של אותה מדגם שהושג על ידי התרגומים והסבבים של סורג iffraction. הרזולוציה של תמונות סופר נפתרו מגיע 100 נמימה ל-500 נארם בהוראות axial עבור 2D-SIM15 או 100 נה”מ לדרבי ו 250 נה”מ בהוראות axial עבור 3D-SIM16.
ההבנה החדשה של הסינאפסה חשובה עוד יותר לאור ההפרעות הנוירולוגיות הרבות שבהן תפקוד לקוי של הסינאפטי ממלא תפקיד מרכזי בהתחלהובהתקדמות 17,18. מחלת אלצהיימר, תסמונת דאון, מחלת פרקינסון, מחלות פריון, אפילפסיה, הפרעות בספקטרום האוטיזם ותסמונת X שברירי בין היתר קושרו לחריגות בהרכב סינפטי, מורפולוגיה ותפקוד19,20,21,22.
לאחרונה, באמצעות קבוצה של נוגדנים ספציפיים SUMO, השתמשנו SIM כדי להראות התאמה לשפות אחרות בנוירונים היפוקמפוס ראשוניים של חלבוני SUMO עם סינפטופיזין סמנים לפני ופוסט סינפטי ו PSD95 ברמת סופר רזולוציה23. זה איפשר לנו לאשר ראיות ביוכימיות ומיקרוסקופיות קונפוקליות של התאמה סומו לנוירונים.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי ללמוד את ההתקמה של חלבונים בנוירונים ראשוניים היפוקמפוס העכבר. במקביל, פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם לסוגים שונים של תרבויות עצביות עיקריות.
ההכלה של המבנה וההרכב של הסינסה חיונית להבנת התהליכים הפיזיולוגיים והפתולוגיים המווסתים את הזיכרון וההכרה. בעוד במצב נורמלי, סינופסות הן אבני הבניין של זיכרון, הם גם בבסיס הפרעות נוירולוגיות מורכבות כגון מחלת אלצהיימר32. הפרוטוקול המתואר כאן משמש לחקר ההתיקות הליקוטית של חל?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להודות לאדוארדו מיצוטי על הביקורת הבונה על כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי BrightFocus A2019296F, על ידי פונדו די Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), על ידי Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) ועל ידי מארי Skłodowska-Curie חדשני הדרכה רשת (JK).
0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
Alexa | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
DyLight | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | – | Instrument |
Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |