Imagem de super-resolução para estudar co-localização de proteínas e marcadores sinápticos em neurônios primários
Summary
Este protocolo mostra como empregar microscopia de super-resolução para estudar a co-localização de proteínas em culturas neuronais primárias.
Abstract
Sinapses são os elementos funcionais dos neurônios e seus defeitos ou perdas são a base de várias doenças neurodegenerativas e neurológicas. Estudos de imagem são amplamente utilizados para investigar sua função e plasticidade em condições fisiológicas e patológicas. Devido ao seu tamanho e estrutura, estudos de localização de proteínas requerem técnicas de imagem de alta resolução. Neste protocolo, descrevemos um procedimento para estudar em neurônios primários a co-localização de proteínas-alvo com marcadores sinápticos em um nível de super-resolução utilizando microscopia de iluminação estruturada (SIM). SIM é uma técnica de iluminação de luz padronizada que dobra a resolução espacial da microscopia de campo largo, atingindo um detalhe de cerca de 100 nm. O protocolo indica os controles e configurações necessários para estudos robustos de co-localização e uma visão geral dos métodos estatísticos para analisar adequadamente os dados de imagem.
Introduction
A compreensão e visão da sinapse mudou enormemente desde sua primeira descrição por1Foster e Sherrington em 18971 . Desde então, nosso conhecimento da comunicação neuronal e dos processos moleculares por trás dela tem crescido exponencialmente2. Tornou-se claro que as sinapses podem ser consideradas como um sistema de dois compartimentos: um compartimento pré-sináptico contendo vesículas para a liberação de neurotransmissores e um compartimento pós-sináptico com receptores3. Essa visão simplista, nos últimos vinte anos, evoluiu para uma complexa rede de proteínas necessárias para transdutor de transmissão ligado à sinalização4.
Os ganhos no entendimento se devem, em parte, às técnicas de super-resolução que superaram o limite de difração da microscopia de luz convencional para se adequar melhor à dimensão das sinapses5,,6,,7,,8,,9,,10. Devido ao limite de difração, um microscópio óptico não pode atingir uma resolução acima de 200 nm lateralmente11,12. Para contornar esse limite, foram criadas técnicas de super-resolução, utilizando diferentes abordagens e atingindo diferentes resoluções de limite de subditração: SIM, STED (Estimulada Microscopia de Esgotamento de Emissões), PALM (Microscopia de Localização FotoAtivada) e STORM (Microscopia óptica de Reconstrução Estocástica)13,14. O SIM dobra a resolução espacial de sistemas de microscopia de campo largo baseados em laser inserindo uma grade de difração no feixe de excitação15. A grade móvel difunde os raios laser para criar um padrão de iluminação conhecido, geralmente listras. Este padrão de luz estruturado propositalmente é sobreposto à distribuição espacial desconhecida do corante fluorescente (da amostra). As franjas de interferência formadas pelos dois padrões codificam para detalhes finos indistinguíveis com microscopia de campo largo normal. A imagem super-resolvida final é obtida pela combinação e decodificação com métodos matemáticos várias imagens brutas da mesma amostra obtidas pelas traduções e rotações da grade de difração. A resolução das imagens super-resolvidas atinge 100 nm na lateral e 500 nm nas direções axial para 2D-SIM15 ou 100 nm na lateral e 250 nm nas direções axial para 3D-SIM16.
O novo entendimento da sinapse é ainda mais importante à luz das muitas doenças neurológicas onde a disfunção sináptica desempenha um papel importante no início e progressão17,18. Doença de Alzheimer, Síndrome de Down, Doença de Parkinson, doenças de príon, epilepsia, transtornos do espectro autista e síndrome do X frágil, entre outros, têm sido associadas a anormalidades na composição sináptica, morfologia e função19,,20,,21,22.
Recentemente, utilizando um conjunto de anticorpos específicos do SUMH, usamos o SIM para mostrar a co-localização nos neurônios hipocampais primários das proteínas SUMO com os marcadores pré e pós-sináptico sinaptophysin e PSD95 no nível de super resolução23. Isso nos permitiu confirmar evidências de microscopia bioquímica e confocal da localização do SUM nos neurônios.
Aqui, descrevemos um protocolo para estudar a localização de proteínas em neurônios primários hipocampais de camundongos. Ao mesmo tempo, este protocolo pode ser adaptado a diferentes tipos de culturas neuronais primárias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elucidar a estrutura e a composição da sinapse é crucial para a compreensão dos processos fisiológicos e patológicos que regulam a memória e a cognição. Enquanto no estado normal, as sinapses são os blocos de construção da memória, elas também estão por trás de distúrbios neurológicos complexos, como a doença de Alzheimer32. O protocolo descrito aqui serve para estudar a co-localização de proteínas neuronais com uma técnica de microscopia de super resolução chamada SIM. Ut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Edoardo Micotti pela crítica construtiva ao manuscrito. Este estudo foi apoiado pela BrightFocus A2019296F, por Fondo di Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), pela Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) e pela Rede de Treinamento Inovador Marie Skłodowska-Curie (JK).
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | – | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
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