Análisis de manchas de ARN para la detección y cuantificación de microARN de plantas
Summary
Este método demuestra el uso de la técnica de hibridación del norte para detectar miRNAs a partir del extracto total de ARN.
Abstract
Los microARN (miRNAs) son una clase de ARN pequeños expresados endógenamente, de 21 nt de pequeñas ANas implicadas en la regulación de la expresión génica tanto en plantas como en animales. La mayoría de los miRNAs actúan como interruptores negativos de la expresión génica dirigidos a genes clave. En las plantas, las transcripciones primarias de miRNAs (pri-miRNAs) son generadas por ARN polimerasa II, y forman diferentes longitudes de estructuras estables de bucle de tallo llamadas pre-miRNAs. Una endonucleasa, como Dicer1, procesa los pre-miRNAs en dúplex miRNA-miRNA*. Una de las hebras del dúplex miRNA-miRNA* se selecciona y se carga en la proteína Argonaute 1 o sus homólogos para mediar el escote de los ARNM objetivo. Aunque los miRNAs son moléculas clave de señalización, su detección a menudo se lleva a cabo por métodos basados en PCR menos que óptimos en lugar de un análisis sensible de la mancha del norte. Describimos un método norte simple, fiable y extremadamente sensible que es ideal para la cuantificación de los niveles de miRNA con muy alta sensibilidad, literalmente de cualquier tejido vegetal. Además, este método se puede utilizar para confirmar el tamaño, la estabilidad y la abundancia de miRNAs y sus precursores.
Introduction
El reciente descubrimiento de pequeñas ARN reguladoras, microRNAs, ha liderado la investigación para entenderlos y su papel en plantas y animales1. Los precursores largos de los miRNAs se procesan en miRNAs maduras de 21 a 24 nt por HYL1 y proteínas específicas similares a los dados2,,3. Un miRNA de 22 nt puede iniciar el silenciamiento en cascada generando siRNAs secundarios4. Los estudios han demostrado el papel de los miRNAs y los siRNAs secundarios en el desarrollo, el destino celular y las respuestas de tensión5,,6.
La hibridación del norte es un método experimental empleado rutinariamente para detectar moléculas específicas de ARN. Este método personaliza su uso en la detección de aproximadamente 19 -24 nt largos RNAs pequeños de un grupo de ARNtotales 7. En esta demostración, ilustramos el uso de esta técnica para la detección y cuantificación de miRNAs. Este método utiliza el etiquetado de sondas utilizando radioisótopos; por lo tanto, los niveles de miRNA en la muestra se pueden detectar con mayor sensibilidad. A diferencia de los métodos basados en PCR, este método garantiza la cuantificación de la expresión, así como la determinación del tamaño de los miRNAs. En este protocolo, mostramos pasos cruciales que mejoran la detección de miRNA. Hemos modificado pasos en hinchazón e hibridación para obtener la detección de señal de alta resolución de miRNAs. Esta técnica también se puede utilizar para la detección de otros ARN pequeños endógenos tales como siRNAs, ARN-secundarios tasi y snoRNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método se puede utilizar ampliamente para la detección y cuantificación de ARN pequeños, incluidos los miRNAs menos abundantes. El protocolo describe principalmente los pasos para desnaturalizar el ARN total en un tampón de carga, la separación del tamaño por electroforesis de gel, la transferencia de ARN a una membrana, la interconexión del ARN en la membrana e hibridar utilizando las sondas oligoeléctricas radiomarcadas deseadas.
El paso crítico para cualquier experimento de h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el acceso al laboratorio de radiación proporcionado por el instituto anfitrión y BRIT para radioisótopo. El laboratorio PVS cuenta con el apoyo del Centro Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Tata de Investigación y Subvenciones Fundamentales (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) del Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India. MP reconoce DBT-Research Associateship, DBT, Gobierno de la India.
Materials
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
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- Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
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- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
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