RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs
Summary
Diese Methode demonstriert die Verwendung der nördlichen Hybridisierungstechnik, um miRNAs aus dem gesamten RNA-Extrakt zu detektieren.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse endogen exprimierter nicht-kodierender, 21 nt kleiner RNAs, die an der Regulierung der Genexpression sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren beteiligt sind. Die meisten miRNAs fungieren als negative Schalter der Genexpression, die auf Schlüsselgene abzielen. In Pflanzen werden primäre miRNAs (pri-miRNAs) Transkripte durch RNA-Polymerase II erzeugt und bilden unterschiedliche Längen stabiler Stammschleifenstrukturen, die als pre-miRNAs bezeichnet werden. Eine Endonuklease, Dicer-like1, verarbeitet die pre-miRNAs zu miRNA-miRNA*-Duplexen. Einer der Stränge aus miRNA-miRNA* Duplex wird ausgewählt und auf das Argonaute 1-Protein oder dessen Homologe geladen, um die Spaltung von Ziel-mRNAs zu vermitteln. Obwohl miRNAs wichtige Signalmoleküle sind, wird ihre Detektion oft mit weniger als optimalen PCR-basierten Methoden anstelle einer empfindlichen Nordfleckanalyse durchgeführt. Wir beschreiben eine einfache, zuverlässige und extrem empfindliche nordeuropäische Methode, die ideal für die Quantifizierung von miRNA-Spiegeln mit sehr hoher Empfindlichkeit ist, buchstäblich aus jedem Pflanzengewebe. Zusätzlich kann diese Methode verwendet werden, um die Größe, Stabilität und die Fülle von miRNAs und ihren Vorläufern zu bestätigen.
Introduction
Die jüngste Entdeckung kleiner regulatorischer RNAs, microRNAs, hat die Forschung dazu geführt, sie und ihre Rolle bei Pflanzen und Tieren zu verstehen1. Lange Vorläufer von miRNAs werden von HYL1 und spezifischen dicer-ähnlichen Proteinen2,3zu 21 bis 24 nt reifen miRNAs verarbeitet. Eine 22 nt miRNA kann Kaskaden-Silencing initiieren, indem sekundäre siRNAs4generiert wird. Studien haben die Rolle von miRNAs und sekundären siRNAs bei der Entwicklung, dem Zellschicksal und den Stressreaktionen5,6gezeigt.
Die Nordhybridisierung ist eine experimentelle Methode, die routinemäßig zum Nachweis bestimmter RNA-Moleküle eingesetzt wird. Diese Methode passt ihre Verwendung bei der Erkennung von ca. 19 -24 nt langen kleinen RNAs aus einem Pool von RNAsinsgesamt 7an. In dieser Demo veranschaulichen wir den Einsatz dieser Technik zur Detektion und Quantifizierung von miRNAs. Bei dieser Methode werden Sonden mit Radioisotopen gekennzeichnet; daher können miRNA-Spiegel in der Probe mit erhöhter Empfindlichkeit nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu PCR-basierten Methoden gewährleistet diese Methode die Quantifizierung der Expression sowie die Größenbestimmung der miRNAs. In diesem Protokoll zeigen wir entscheidende Schritte zur Verbesserung der miRNA-Erkennung. Wir haben Schritte in Derblotting und Hybridisierung modifiziert, um eine hochauflösende Signalerkennung von miRNAs zu erhalten. Diese Technik kann auch für den Nachweis anderer endogener kleiner RNAs wie siRNAs, tasi-sekundäre RNAs und snoRNAs verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode kann ausgiebig für die Detektion und Quantifizierung kleiner RNAs einschließlich weniger reichlich vorhandener miRNAs verwendet werden. Das Protokoll beschreibt hauptsächlich die Schritte zur Denaturierung der gesamten RNA in einem Ladepuffer, Größentrennung durch Gelelektrophorese, Übertragung von RNA auf eine Membran, Vernetzung der RNA auf Membran und Hybridisierung mit gewünschten radioaktiv markierten Oligosonden.
Der entscheidende Schritt für jedes Blotting-Experime…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bestätigen den Zugang zum Strahlenlabor des Gastinstituts und BRIT für Radioisotope. PVS-Labor wird unterstützt vom National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research und Stipendien (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) vom Department of Biotechnology, Government of India. MP erkennt DBT-Research Associateship, DBT, Regierung von Indien.
Materials
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
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- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
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