RNA Blot Analyse voor de detectie en kwantificering van Plant MicroRNAs
Summary
Deze methode toont het gebruik van de noordelijke hybridisatie techniek om miRNAs te detecteren van de totale RNA extract.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse van endogene uitgedrukte niet-codering, ~ 21 nt kleine RNAs die betrokken zijn bij de regulering van genexpressie in zowel planten als dieren. De meeste miRNAs fungeren als negatieve schakelaars van genexpressie gericht op belangrijke genen. In planten worden primaire miRNAs (pri-miRNAs) transcripties gegenereerd door RNA polymerase II, en ze vormen verschillende lengtes van stabiele stam-lusstructuren genaamd pre-miRNAs. Een endonuclease, Dicer-like1, verwerkt de pre-miRNAs tot miRNA-miRNA* duplexen. Een van de strengen van miRNA-miRNA* duplex wordt geselecteerd en geladen op Argonaute 1-eiwit of de homologs ervan om het decolleté van doelmrnas te bemiddelen. Hoewel miRNAs belangrijke signaalmoleculen zijn, wordt hun detectie vaak uitgevoerd door minder dan optimale PCR-gebaseerde methoden in plaats van een gevoelige noordelijke vlekanalyse. We beschrijven een eenvoudige, betrouwbare en uiterst gevoelige noordelijke methode die ideaal is voor de kwantificering van miRNA-niveaus met een zeer hoge gevoeligheid, letterlijk van elk plantweefsel. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de grootte, stabiliteit en de overvloed aan miRNAs en hun precursoren te bevestigen.
Introduction
De recente ontdekking van kleine regulerende RNAs, microRNAs, heeft geleid tot onderzoek in het begrijpen van hen en hun rol in planten en dieren1. Lange voorlopers van miRNAs worden verwerkt tot 21 tot 24 nt volwassen miRNAs door HYL1 en specifieke dicer-achtige eiwitten2,3. Een miRNA van 22 nt kan cascade-uitschakeling initiëren door secundaire siRNAs4te genereren. Studies hebben aangetoond dat de rol van miRNAs en secundaire siRNAs in ontwikkeling, cellot en stress reacties5,6.
Noordelijke hybridisatie is een experimentele methode die routinematig wordt gebruikt om specifieke RNA-moleculen te detecteren. Deze methode past het gebruik ervan aan bij de detectie van ongeveer 19-24 nt lange kleine RNAs uit een pool van totale RNAs7. In deze demonstratie illustreren we het gebruik van deze techniek voor de detectie en kwantificering van miRNAs. Deze methode maakt gebruik van de etikettering van sondes met behulp van radio-isotopen; zo kunnen miRNA-niveaus in het monster worden gedetecteerd met een verhoogde gevoeligheid. In tegenstelling tot pcr-gebaseerde methoden, deze methode zorgt voor kwantificering van de expressie, alsmede de grootte bepaling van de miRNAs. In dit protocol laten we cruciale stappen zien die de miRNA-detectie verbeteren. We hebben stappen in blotting en hybridisatie aangepast voor het verkrijgen van hoge resolutie signaaldetectie van miRNAs. Deze techniek kan ook worden gebruikt voor de detectie van andere endogene kleine RNAs zoals siRNAs, tasi-secundaire RNAs en snoRNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode kan op grote schaal worden gebruikt voor detectie en kwantificering van kleine RNAs, waaronder minder overvloedige miRNAs. Het protocol beschrijft voornamelijk de stappen voor het denatureren van het totale RNA in een laadbuffer, groottescheiding door gel elektroforese, overdracht van RNA naar een membraan, kruis-link het RNA op membraan en hybridiseren met behulp van de gewenste radiolabeled oligo sondes.
De cruciale stap voor elk blotting experiment is het gebruik van goede kwal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de toegang tot stralingslab die door het gastinstituut en BRIT voor radio-isotoop wordt verstrekt. PVS laboratorium wordt ondersteund door National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research and grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) van het Department of Biotechnology, Regering van India. MP erkent DBT-Research Associateship, DBT, Regering van India.
Materials
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
