RNA Blot Analisi per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali
Summary
Questo metodo dimostra l’uso della tecnica di ibridazione settentrionale per rilevare i miRNA dall’estratto totale di RNA.
Abstract
I microRNA (miRNA) sono una classe di RNA non codificanti endogenamente espressi, da 21 nt piccoli RNA coinvolti nella regolazione dell’espressione genica sia nelle piante che negli animali. La maggior parte dei miRNA agisce come interruttori negativi dell’espressione genica mirata ai geni chiave. Nelle piante, le trascrizioni primarie di miRNA (pri-miRNA) sono generate dalla polimerasi RNA II e formano lunghezze variabili di strutture stabili ciclo-stelo chiamate pre-miRNA. Un endonuclease, simile a Dicer1, elabora i pre-miRNA in duplex miRNA-miRNA. Uno dei filamenti del duplex miRNA-miRNA è selezionato e caricato sulla proteina Argonaute 1 o sui suoi omologhi per mediare la scissione degli mRNA bersaglio. Sebbene i miRNA siano molecole chiave di segnalazione, il loro rilevamento viene spesso effettuato con metodi non ottimali basati sulla PCR anziché con un’analisi sensibile delle macchie settentrionali. Descriviamo un metodo settentrionale semplice, affidabile ed estremamente sensibile che è ideale per la quantificazione dei livelli di miRNA con una sensibilità molto elevata, letteralmente da qualsiasi tessuto vegetale. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per confermare la dimensione, la stabilità e l’abbondanza di miRNA e dei loro precursori.
Introduction
La recente scoperta di piccoli RNA regolatori, i microRNA, ha guidato la ricerca nella loro comprensione e del loro ruolo nelle piante e negli animali1. I precursori lunghi dei miRNA vengono elaborati in miRNA maturi da 21 a 24 nt da HYL1 e specifiche proteine simili adicer2,,3. Un miRNA da 22 nt può avviare il silenziamento a cascata generando siRNA secondari4. Gli studi hanno dimostrato il ruolo dei miRNA e dei siRNA secondari nello sviluppo, nel destino cellulare e nelle risposte allo stress5,6.
L’ibridazione settentrionale è un metodo sperimentale regolarmente impiegato per rilevare specifiche molecole di RNA. Questo metodo personalizza il suo utilizzo nel rilevamento di circa 19 -24 nt lunghi piccoli RNA da un pool di RNA totali7. In questa dimostrazione viene illustrato l’utilizzo di questa tecnica per il rilevamento e la quantificazione dei miRNA. Questo metodo utilizza l’etichettatura delle sonde utilizzando i radioisotopi; pertanto, i livelli di miRNA nel campione possono essere rilevati con una maggiore sensibilità. A differenza dei metodi basati su PCR, questo metodo garantisce la quantificazione dell’espressione e la determinazione delle dimensioni dei miRNA. In questo protocollo, mostriamo passaggi cruciali che migliorano il rilevamento di miRNA. Abbiamo modificato le fasi di blotting e ibridazione per ottenere il rilevamento del segnale ad alta risoluzione dei miRNA. Questa tecnica può essere utilizzata anche per il rilevamento di altri piccoli RNA endogeni come siRNA, RNA tasi-secondari e snoRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo metodo può essere ampiamente utilizzato per il rilevamento e la quantificazione di piccoli RNA, compresi i miRNA meno abbondanti. Il protocollo descrive principalmente i passaggi per decolorare l’RNA totale in un buffer di carico, la separazione delle dimensioni mediante elettroforesi gel, il trasferimento di RNA in una membrana, il collegamento incrociato dell’RNA sulla membrana e l’ibridazione utilizzando sonde oligo radioetichettate desiderate.
Il passo critico per qualsiasi esperim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono l’accesso al laboratorio di radiazioni fornito dall’istituto ospitante e BRIT per il radioisotopo. Il laboratorio PVS è supportato dal National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research and grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Svizzera/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) del Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell’India. MP riconosce DBT-Research Associateship, DBT, Government of India.
Materials
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
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