Summary

Análise de blot de RNA para detecção e quantificação de MicroRNAs vegetais

Published: July 11, 2020
doi:

Summary

Este método demonstra o uso da técnica de hibridização do norte para detectar miRNAs a partir do extrato total de RNA.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de não codificação expressa endógenamente expressa, ~21 nt pequenos RNAs envolvidos na regulação da expressão genética em plantas e animais. A maioria dos miRNAs atuam como interruptores negativos de expressão genética visando genes-chave. Nas plantas, as transcrições miRNAs primárias (pri-miRNAs) são geradas pela polimerase RNA II, e formam diferentes comprimentos de estruturas estáveis de laço-tronco chamadas pré-miRNAs. Uma endonuclease, semelhante a Dicer1, processa os pré-miRNAs em duplexes miRNA-miRNA*. Um dos fios do duplex miRNA-miRNA* é selecionado e carregado na proteína Argonaute 1 ou seus homólogos para mediar o decote dos mRNAs alvo. Embora os miRNAs sejam moléculas-chave de sinalização, sua detecção é frequentemente realizada por métodos baseados em PCR menos que ideais em vez de uma análise sensível da mancha do norte. Descrevemos um método norte simples, confiável e extremamente sensível que é ideal para a quantificação dos níveis de miRNA com sensibilidade muito alta, literalmente de qualquer tecido vegetal. Além disso, este método pode ser usado para confirmar o tamanho, estabilidade e a abundância de miRNAs e seus precursores.

Introduction

A recente descoberta de pequenas RNAs regulatórias, microRNAs, tem liderado pesquisas para entendê-las e seu papel em plantas e animais1. Precursores longos de miRNAs são processados em miRNAs maduros de 21 a 24 nt por HYL1 e proteínas específicas semelhantes a dicer2,,3. Um miRNA de 22 nt pode iniciar o silenciamento em cascata gerando siRNAssecundárias 4. Estudos têm mostrado o papel das miRNAs e siRNAs secundárias no desenvolvimento, destino celular e respostas ao estresse5,6.

A hibridização do norte é um método experimental rotineiramente empregado para detectar moléculas específicas de RNA. Este método personaliza seu uso na detecção de aproximadamente 19 -24 nt de comprimento pequeno RNAs de um pool de RNAs totais7. Nesta demonstração, ilustramos o uso desta técnica para a detecção e quantificação de miRNAs. Este método utiliza rotulagem de sondas usando radioisótopos; assim, os níveis de miRNA na amostra podem ser detectados com maior sensibilidade. Ao contrário dos métodos baseados em PCR, este método garante quantificação de expressão, bem como determinação de tamanho dos miRNAs. Neste protocolo, mostramos passos cruciais que melhoram a detecção de miRNA. Modificamos etapas em blotting e hibridização para obtenção de detecção de sinal de alta resolução de miRNAs. Esta técnica também pode ser usada para a detecção de outros RNAs pequenos endógenos, como siRNAs, RNAs tasi-secundários e snoRNAs.

Protocol

1. Preparação de um gel de poliacrilamida de 15% de desnaturação Pesar e adicionar 4,8 g de ureia, adicionar 3,75 mL de 40% de acrilamida: solução bisacrilamida (19:1) e 1 mL de 10x TBE pH 8.2 em um tubo estéril de 50 mL. Dissolva a ureia usando um banho de água a 60 °C em uma solução clara. Recarrege o volume para 10 mL usando água estéril recém-autoclavada e esfrie a mistura de gel à temperatura ambiente. Prepare a solução fresca de persulfito de amônio de 10% (…

Representative Results

Nesta demonstração, detectamos e quantificamos a expressão do miR397 em diferentes tecidos de arroz indica var whiteponni(Figura 1). miR397 é um miRNA de 22 nt e miRNA conservado. A expressão do miR397 pode ser detectada em todas as amostras testadas. De acordo com os dados de sequenciamento de próxima geração, a amostra 1 (tecido de mudas) tem miR397 a 5 leituras por milhão (rpm). Detectamos seu sinal confortavelmente, indicando que o método é muito sensível e …

Discussion

Este método pode ser amplamente utilizado para detecção e quantificação de pequenos RNAs, incluindo miRNAs menos abundantes. O protocolo descreve principalmente os passos para desnaturar o RNA total em um buffer de carregamento, separação de tamanho por eletroforese de gel, transferência de RNA para uma membrana, cruzar o RNA para a membrana e hibridizar usando sondas oligo chamadas radiolabeled desejadas.

O passo crítico para qualquer experimento de manchas é o uso de RNA de boa qua…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem o acesso ao laboratório de radiação fornecido pelo instituto anfitrião e pelo BRIT para radioisótopos. O laboratório PVS é apoiado pelo Centro Nacional de Ciências Biológicas do Instituto Tata de Pesquisa Fundamental e bolsas (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) do Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia. MP reconhece DBT-Research Associateship, DBT, Governo da Índia.

Materials

40% Acrylamide-bisacrylamide solution Sigma A9926
Ammonium persulphate (APS) BioRad 1610700
Blotting paper whatmann blotting paper I 1001-125
Bromophenol blue Sigma B5525-5G
Capillary loading tips BioRad 2239915
Deionized formamide Ambion AM9342
Heating block Eppendorff 5350
Hybond N+nylon membrane GE RPN203B
Hybridization bottle Sigma Z374792-1EA
Hybridization Oven Thermo Scientific 1211V79
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma T7024-25ml
PhosphorImager GE- Typhoon scanner 29187194
PhosphorImager screen and cassette GE healthcare GE28-9564-75
Pipettes Gilson, models: P20 and P10 FA10002M, FA10003M
Plastic pipette Falcon 357550
Polyacrylamide gel apparatus BioRad 1658003EDU
Sephadex G-25 column GE healthcare 27532501
Speed Vac Concentrator Thermo Scientific 20-548-130
Spinwin Tarsons 1010
T4 Polynucleotide Kinase (PNK) NEB M0201S
Transblot apparatus BioRad 1703946
ULTRAHyb hybridization buffer Ambion AM8670
Urea Fischer Scientific 15985
UV-crosslinker UVP CL-1000L
Vortex Tarsons 3020
Water bath NEOLAB D-8810
Xylene cyanol Sigma X4126-10G

References

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  10. Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).

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Cite This Article
Tirumalai, V., Prasad, M., Shivaprasad, P. V. RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs. J. Vis. Exp. (161), e61394, doi:10.3791/61394 (2020).

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